【原】斑马鱼Dio3b基因敲除模型的构建

一、材料

Tuebingen(TU)品系野生型斑马鱼，饲养于上海第九人民医院中心实验室地下室鱼房，斑马鱼饲养繁殖系统由北京爱生科技有限公司建造，养殖条件控制在水温(28±1)℃、pH值7.2、光照/黑暗周期14 h/10 h。PCR引物和oligo由上海铂尚生物合成；PCR Taq酶购于莱枫生物公司、高保真酶KOD-201购于日本东洋纺公司；质粒连接载体pGEM-T Easy Vector System I购于Promega公司；质粒小提试剂盒购于Axygen公司；快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(康为世纪，CW2302M)购于康为世纪公司；LB培养基组分胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠均购自上海生工；Bbs I与Xba I核酸内切酶、sgRNA与Cas9mRNA体外转录及纯化试剂盒均购于美国赛默飞公司；T7核酸内切酶购于NEB公司；Narishige显微注射仪、高端体式显微镜购于日本尼康公司。

二、方法

1．CRISPR-Cas9的设计与合成：

(1)合成双链DNA靶序列：在生物信息网站Ensembl genome browser 91上查询斑马鱼Dio3b基因的基因组信息，把外显子序列从第一个外显子开始逐一放入Cas9靶位点预测网站(http：//zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx)搜寻合适的打靶位点，确定敲除位点位于一号外显子区域的功能序列，靶序列为GGCGCACCCGTCCGACGGCT，与靶点结合序列将一对oligo退火形成双链(表1)。(2)构建gRNA体外转录模板：以p-T7-gRNA为gRNA的克隆与体外转录载体，用BbsI酶切pT7-gRNA、切胶回收，得到gRNA克隆骨架pT7-gRNA_BbsI，将退火后的片段与回收的上述gRNA克隆骨架连接、转化、挑取克隆送测序，选择测序正确的克隆提取质粒。用T7-crfwd和tracr rev引物对(表1)，以构建好的gRNA体外转录载体为模板，使用高保真酶PCR，引物序列见表1，程序(58℃退火，延伸30 s，40个循环，40 μl体积)，取1 μl PCR产物电泳，确认为125 bp的单一条带后直接回收PCR产物。(3)构建Cas9 mRNA体外转录模板：将pT7-2sNLS-spCas9载体(Amp抗性)用XbaI单酶切线性化；电泳检测确认质粒完全线性化后，割胶回收纯化。(4)体外转录sgRNA和Cas9mRNA: 利用体外转录试剂盒对纯化后的sgRNA PCR产物和线性pT7-2sNLS-spCas9质粒进行体外转录反应，并对转录后的RNA通过纯化试剂盒进行纯化。用NanoDrop2000紫外分光光度计对转录的sgRNA和Cas9 mRNA进行浓度测定后冻存于－80℃冰箱。

2．Dio3b－/－斑马鱼的鉴定与筛选：

(1)显微注射：将成年野生型斑马鱼按照雌∶雄为2∶1比例配对，次日清晨光照刺激下排卵，收集受精卵并在胚胎处于单细胞阶段时进行显微注射，注射前先将Cas9 mRNA和Dio3b gRNA按照浓度300∶25比例充分混合，每只胚胎注射2 nl，一共注射约200只。(2)基因敲除鉴定：取于胚胎出生后3天注射后表型正常的胚胎(10枚，1枚/管)，提取基因组DNA，PCR、T7酶切检测靶位点敲除效率。选择敲除效率和存活率较高的同批次注F0胚胎养大至性成熟，取F0代雄鱼精子通过PCR和测序鉴定基因型，反应条件设置为：第1步，95℃预变性5 min；第2步，95℃变性30 s、退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；第3步，终延伸72℃ 5 min，确定该F0产生的突变类型；选择可产生移码突变的F0雄鱼与野生型雌鱼外交产生F1代；将F1饲养至1～2个月，剪尾鳍，提基因组DNA，通过PCR和酶切逐条进行基因检测，筛选出F1杂合子；携带相同突变的F1杂合子自交得到F2代，对F2代剪尾进行基因型鉴定即可筛选出Dio3b纯合子。

3．心率计数：

经过筛选出来的基因型明确的F2代Dio3b－/－和野生型成年斑马鱼，自交后产生胚胎的Dio3b－/－胚胎作为实验组，野生型胚胎作为对照，放入光照培养箱中孵育，待胚胎发育至出生后6 h原肠胚时期时，镜下观察发育状态并清除发育异常的个体。1天更换一半的胚胎培养液并及时清替换死去的胚胎斑马鱼发育到胚胎出生后48 h，使用尖头镊子手工去绒膜，平静4 min，将胚胎摆放到体式显微镜视野中央，调整放大倍数和焦距使斑马鱼心脏位置清晰可见，拍下30 s视频(帧率≥20 fps)，实验组和对照组每组拍10条；视频回放，统计每只鱼30 s内心脏跳动的次数，每个视频重复数3次，取3次计数的平均值×2作为心率的数值。

4．运动行为测定：

发育至5、6和7 d的幼鱼，从培养箱内取出，取48孔板，每孔加入1 ml的胚胎培养液，将孵育好的胚胎每孔1只放入48孔板，2组各取96只，将48孔板放入观察箱后，不加盖子，使得观察箱内的光照与温度保持与培养箱内条件保持一致，在行为观察系统(Zebrabox Viewpoint Life Sciences)下检测。采用Locomotor activity模块下追踪斑马鱼运动轨迹，Videotrack V3软件记录并量化运动数据，首先适应5 min，然后开始采集时长为5 min的自发运动视频，同时记录观察期内的运动数据。独立进行3次实验，并且使用定制的OpenOffice.org软件进行数据分析，以5 min之内的运动距离总和(mm)作为指标评价斑马鱼幼鱼的运动能力。

三、统计学处理

数据的统计分析和作图采用Microsoft Excel和Graphpad Prism软件进行，计量资料以 ±s 表示，单因素组间数据差异分析采用t检验方法分析，以P<0.05为差异有统计学意义。