定量检测是什么

之前文章简要的说明了qPCR原理，本文介绍qPCR应用方面之一：探针法定性检测。

这个副标题好像与主标题不太一致。既然是荧光定量当然要做定量分析，为什么还要用在定性分析上？这个问题就涉及到qPCR最主要的特点：不开盖就可以对产品的有无、拷贝数等进行分析。避免了普通PCR需要开盖对产物进行分析，这样就减少了开盖导致的PCR产物污染。

探针法定性分析主要有两类探针：1.Taqman探针；2.MGB探针。这两个探针各有特点，在前文已经介绍过了，本文就不在赘述。我们就举一个例子说明探针法的定性检测。

2019年底的新冠爆发，国内很多公司研发了新冠核酸检测试剂盒，国外也公布了很多新冠检测引物探针和操作程序。

为什么生病：从新冠核酸检测到PCR引物探针设计1zhuanlan.zhihu.com

图1 试剂盒组成和用途

试剂盒包括了扩增反应液、酶混合液、新冠反应液、阳性对照、空白对照。这里面扩增反应液可能是指PCR buffer，新冠反应液可能是指引物探针。具体不详，如何设置的可能厂家人员才会知道。当然这个不是关键，我们主要分析qPCR当中的质量控制。

上述试剂盒分别有阳性对照和空白对照。这两个都属于外对照，也就是说在进行PCR反应时，需要另外两个反应对阳性对照和阴性对照进行检测，用于检测整个PCR反应程序。

如果阳性对照不起线，呈阴性；样本正常起线，空白对照正常阴性。那可能是阳性对照配置出现问题。

如果阳性对照不起线，呈阴性；样本也不起线，空白对照正常阴性。那可能是反应程序有问题、试剂有问题、加样有问题、阳性对照配置出现问题（样本可能是阴性）等。

如果阳性对照和样本正常起线阳性，空白对照起线。可能实验室存在污染，样本检测结果可能是假阳性。

如果阳性对照正常起线，空白对照正常阴性；样本起线那就判断阳性，不起线就判断阴性。这个判断是正确的吗？

从上面的这些结果分析来看。本试剂盒缺少一个对照，那就是内对照。

所谓内对照就是样本检测时，不管样本阴阳性，内对照必须阳性起线。内对照的作用就是检测反应过程是否出现问题。

也就是说如果单纯只有外对照，而没有内对照。样本检测阴性是不敢肯定是阴性的。因为这个阴性有可能是样本质量较差导致的；也有可能是样本浓度过低导致的；也有可能是样本中存在干扰物质导致的；也有可能是根本就没有加样导致的等等个方面的原因。

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综上所述，qPCR进行样本检测时，必须要设置内对照、外对照（阳性和阴性对照）；两者缺少一个对结果的解释都存在一定的不完美。