【原】细胞系建好了，表型实验实验怎么做？

我相信，同为科研沦落人的你，一定知道只要做了基因编辑细胞株的构建，无论是细胞敲除、敲入，还是点突变、稳转株，都难以逃脱要检测细胞表型的命运。毕竟你构建的细胞系连想要的表型都没有，是很难有底气投高分文章的。 只是，这么多种细胞表型，哪些表型服务检测搭配在一起会更好？做细胞凋亡检测是不是也要检测细胞周期？每种细胞表型都有几种检测方法，要选哪个？

先别急，大部分细胞（尤其是肿瘤细胞）表型研究都离不开细胞增殖、细胞毒性、细胞周期、细胞迁移/侵袭和细胞凋亡这几种表型分析，把这几种表型分析的原理和用途弄明白也许就知道答案了！

1、细胞增殖

细胞增殖（cell proliferation）是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。 通过对比不同细胞组别的生长曲线，比如野生型VS突变体、对照VS过表达、对照VS敲降等等来判断所构建的细胞系的增殖状态是否有显著差异，进而可以选择进行细胞周期或细胞凋亡的检测，如图1呈现的是过表达p62对U87和U251细胞系增殖的影响。

检测细胞增殖的方法有很多，其中常用的是CCK-8检测法和活细胞计数法。计数法不必多说，科研人必备技能，而CCK-8检测法是利用正常细胞的线粒体内含有的琥珀酸脱氢酶可将四唑盐类物质还原为紫色结晶状物质的原理，当这些紫色物质沉积在细胞周围，可以通过酶标仪读取450nm OD值（optical density），从而检测细胞增殖状态。其他方法如BrdU染色法和Ki-67检测法，可以反映出增殖细胞的空间分布，但只能捕获单一时间点的增殖细胞比例，因此一般用于检测组织切片的细胞增殖。

图1

2、细胞周期

通常，在发现细胞增殖有差异后，可以通过检测细胞周期来找出产生差异的原因，比如S、G2和/或M期的细胞减少，而大多数细胞停滞在G1期，那就说明可能是G1/S检验点出现了异常，这对研究深入了解生物的生长发育和控制肿瘤生长等有重要意义。细胞周期的检测方法是简便直观的碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）染色-流式分析法。

碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比，因此可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，由于细胞周期各时相的DNA含量不同，根据DNA含量的分布情况，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期、S期和G2/M期，获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率（图2），进而分析细胞周期是否正常。

图2

3、细胞凋亡

细胞凋亡是多基因严格控制的过程，这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、Caspase家族、抑癌基因P53等。凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤和自身免疫性疾病等，因此如果你是研究肿瘤或退行性疾病，细胞凋亡的检测往往是必要的，因为这一指标将会成为后续机制研究的风向标。

由于细胞凋亡的过程有典型的形态和分子层面的变化，检测方法也是多样的，常用的有Annexin V/PI双染法、TUNEL检测法和Caspase-3活性检测法。其中，Annexin V/PI双染法因其可区分凋亡早期和晚期和方便量化而被广泛使用。磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyl serine,PS)在细胞凋亡的早期，会从细胞膜内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V能与PS高亲和力特异性结合，把绿色荧光分子FITC连接到Annexin-V即可标志内膜翻转的凋亡小体。而当细胞发生凋亡时，细胞膜通透性增强，PI可进入细胞结合DNA并发出荧光。因此通过流式分析Annexin-V-FITC和PI的信号分布便可区分凋亡早期（Annexin-V-FITC阳性+PI阴性）和晚期（Annexin-V-FITC阳性+PI阳性）的细胞（图3）。

图3

4、细胞毒性

在研究疾病的细胞模型中，你或许希望在过表达、敲降或敲除潜在药物靶点的基础上，高通量筛选药物分子库，从而鉴定出潜在的治疗药物，又或者是需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选，那你可以通过细胞毒性检测来筛选敏感化合物，或者筛选不同细胞系对某一化合物多个浓度的敏感性。实现细胞毒性检测的方法有很多种，其中基于细胞代谢活性的CCK-8和ATP检测法指示的是细胞活力（图4），而基于代谢酶泄漏的LDH检测法指示的则是细胞损伤程度（图5），具体可以根据自身的研究需求来选择。

图4

图5

5、细胞迁移、侵袭

在肿瘤治疗中，普遍认为抑制肿瘤细胞迁移和侵袭是有效的治疗手段。因此在对肿瘤细胞进行干预（过表达、敲降、敲除、点突变、药物处理）后对细胞的迁移与侵袭能力进行检测，可以作为评估干预效果的一个有效指标。

检测细胞迁移能力和侵袭能力常用的实验手段是Transwell实验（图6）。Transwell顾名思义是“穿孔实验”，即将小室放在加入完全培养基的24孔板内，小室中含有密密麻麻的小孔，将细胞悬液加到小室中，细胞可通过形变穿过小室中的孔而跑到营养更丰富的小室外部并贴在外侧，最后通过对小室外部的细胞进行染色计数，就可以判断细胞的迁移与侵袭能力的强弱。不过检测迁移和侵袭的实验方法还是存在差异，侵袭检测需在聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶，用以模仿细胞外基质。

图6

说到这里，也许你会发现有时候并不是只检测某一项表型就能够得出实验结论了，而是好几项一起检测，还要结合检测数据进行综合分析，才能得出最终结论。