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自由生活的蓝细菌大约在20亿年前被真核细胞捕获，最终产生了叶绿体。经过一个世纪的争论，在20世纪60年代证明了叶绿体DNA的存在。在20世纪80年代对第一个叶绿体基因组进行了测序，随后在过去三十年中，约100种蔬菜、水果、谷物、饮料、油、淀粉/糖类作物叶绿体基因组被测序。在20世纪80年代后期，外源基因在分离的叶绿体或完整的植物细胞中表达，在20世纪90年代，这些外源基因稳定地整合到叶绿体基因组中，并表现出典型的母体遗传。质体基因组序列揭示了绿色植物系统发育的框架以及质体基因组向其他真核生物转移事件的复杂历史。质体基因之间不一致的历史信号表明整个质体组可能存在可变的限制条件，对这些限制条件的进一步理解和缓解可能会为生物工程带来新的机会。近日，宾夕法尼亚大学的Henry Daniell教授在PBJ上发表了题名为“Green giant – a tiny chloroplast genome with mighty power to produce high-value proteins: history and phylogeny”的综述。这篇综述简要概述了叶绿体的进化历史，叶绿体自主性的变化，使用质体DNA序列数据重建植物进化史，以及叶绿体基因组在生物技术应用中的最新进展和未来用途。同时，这篇综述还关注了日常使用或临床使用的产品（包括COVID-19患者的治疗和SARS-CoV-2疫苗）的最新进展。 
1909年，鲍尔和科伦斯描述了位于原生质体细胞核外的非孟德尔遗传因子的革命性概念。在杂色，黄色和绿色紫茉莉植物之间的杂交中，枝条总是产生相同颜色的幼苗，而没有任何孟德尔分离现象。随后几十年的研究显示了性融合过程中雄性叶绿体DNA不同的排斥机制。在花粉形成过程中生殖细胞分裂不均，不接受任何叶绿体。在被子植物中，每个生殖细胞形成两个精子细胞，其中一个与雌配子融合形成合子，另一个与极核结合产生胚乳，即被称为“双受精”的过程。在此过程中，除了几个例外，雄性叶绿体或DNA被明确排除或降解，从而确保了绝大多数被子植物和其他陆地植物中叶绿体基因组的母系遗传。当将外源基因引入叶绿体基因组中时，叶绿体基因组母本遗传的作用得到了更多的关注。通过花粉进行转基因逃逸以及杂草近缘种捕获这种宝贵性状的可能性一直是核转基因作物中的主要问题。因此，通过叶绿体基因组整合除草剂抗性基因和母体遗传转基因被认为是一项重大成就，并且本发明在Nature Biotechnology上是封面文章。随后，已记录了整合到叶绿体基因组中的许多外来基因的母体遗传。 除了通过母体遗传的转基因遏制外，叶绿体工程还能在叶片中生产产品，在任何生殖结构出现之前促进它们的收获，从而提供完全的遏制。因此，十年前对叶绿体中表达的生物制药产品进行了现场测试（表1）。最近，USDA-APHIS证明“由于不存在植物有害生物成分，转质体组不符合USDA-APHIS法规7 CFR第340部分中受管制物品的定义”。这些优势应有助于通过叶绿体基因组工程化产品的现场生产。 蓝细菌作为叶绿体的进化前体的概念是一个世纪前提出的，并且所有质体的蓝细菌起源现在已经很好地建立起来。大约15–20亿年前，自由生存的蓝细菌被早期的真核细胞所捕获。这种捕获过程已在实验室中通过植物原生质体吸收藻类叶绿体或白化病原生质体吸收绿色叶绿体，以及绿色或杂色植物再生而得到了实验证明。在这一古老的诱捕事件之后，在绿色植物进化的漫长过程中，蓝细菌基因大量转移到核基因组中。在拟南芥中，18％的核基因起源于祖先质体基因组。因此，大多数质体蛋白都是核编码的，并且在遗传上依赖宿主细胞，叶绿体不再是内共生体而是细胞器。从祖先的蓝细菌到光合作用的真核生物中发现的质体基因组，基因含量已大大降低。蓝细菌Synechocystis PCC 6803的基因组为3,573 kb，包含约3,200个基因，红藻Porphya purpurea中的质体基因组仅为191 kb，具有约250个基因。除涉及蛋白质合成和光合作用的基因外，红藻和灰胞藻的质体还编码几种生物合成途径、氮同化和代谢调节的基因。确实，灰胞藻Cyanophora paradoxa的质体基因组包含用于肽聚糖壁生物合成的基因，并且该物种保留了蓝细菌细胞壁。陆地植物进化过程中肽聚糖壁的丢失是减少植物细胞外的质体存活的重要不可逆步骤。大多数陆地植物质体基因组包含110-130个基因，约80个基因编码参与光合作用和其他过程的蛋白质。在寄生植物中，光合作用基因丢失了，但是叶绿体基因组保留了蛋白质合成和DNA复制起点所必需的基因。尽管祖先蓝藻基因组基因大量丢失，但分离的叶绿体仍然有能力进行蛋白质合成，因为它们含有> 50％的光合细胞、DNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶和tRNAs的总核糖体补体。对叶绿体（氯霉素)和胞浆(环己胺）核糖体使用S35蛋氨酸和特异性蛋白质合成抑制剂，可以区分在每个隔间中合成的蛋白质。分离出的完整叶绿体显示出能够合成蛋白的能力，该蛋白能够在环状绿化过程中通过环磷酸化实现光系统I的活性，并形成具有光系统II活性的大颗粒。值得注意的是，当所有光合作用基因丧失时，寄生植物中的蛋白质合成能力得以保留。Renner创造了术语“质体基因组”来描述质体遗传因子（表1）。尽管在质体中存在DNA已有数十年的争议，但Ris和Plaut首次使用具有25 A微纤丝大小，对核酸酶降解和富尔根氏反应敏感和吖啶橙染色的黄绿色荧光的电子显微照片，令人信服地证明了衣藻叶绿体中DNA的存在。随后，DNA被显示在蚕豆和其他叶绿体中，被称为“卫星DNA”。发现细胞器DNA后的二十年，Shinozaki等人于1986年发布了第一个叶绿体基因组（烟草）的完整叶绿体基因组。在接下来的十年中，仅公布了少量农作物叶绿体基因组序列，而缺乏数据是工程农作物叶绿体基因组的主要限制。误解是叶绿体基因组序列在作物叶绿体基因组中高度保守。然而，约50％的叶绿体基因组包含高度保守的编码序列，但对转基因整合必不可少的或包含调控序列的基因间序列却不保守。因此，具有内源性基因和调控序列的物种特异性叶绿体载体是有效的外源基因表达所必需的。基于上述工作，在过去十年中，人们为测序农作物叶绿体基因组进行了重大努力，这些基因组用于日常生活中，包括大豆，其他豆类，马铃薯，番茄，葡萄，咖啡，棉花，橙子，木薯，胡萝卜和谷物。如下文所述，叶绿体基因组序列促进密码子优化并提供最佳的调控序列，以增强翻译和转基因整合。了解经济上重要的栽培物种的起源有助于育种，并防止用于草药的植物交叉污染。此外，就结构和序列而言，了解叶绿体基因组多样性对于开发有效的基因工程系统很重要。但是，在约3,000种耕作作物中，只有不到70个属可获得完整测序的叶绿体基因组。其中，NCBI数据库中提供了<80个完整的叶绿体基因组。但是，“一千种植物转录组计划”（1KP; onekp.com）以及最近的其他努力为全球数据库贡献了1,000多个完整或接近完整的质体基因组，其中大部分来自经济意义不大的植物；因此，在过去的十年中，我们对整个生命之树中质体基因组的了解得到了极大的提高。由于多种原因（丰度，单拷贝基因，缺乏重组以及核苷酸进化的适当速率），质体基因组长期以来一直是研究植物系统发育和进化的主要动力。质体基因组的大小和结构在整个陆地植物进化过程中都显着的保守（尽管基因间隔区和调控序列并不十分保守），这与植物线粒体基因组的大小和结构的巨大变化形成了鲜明的对比，这种保守性促进了系统发育分析中序列数据和质体重排的使用。如上所述，在绿色植物进化的过程中，基因从质体组转移到核基因组已经减小了质体基因组的大小，其中绿藻类具有比质体植物更大的质体基因组和更多的基因，特别是陆地植物。也有一些质体基因移动到线粒体基因组的证据。已经从物种水平和到极深的水平上跨越一系列的分歧，利用质体基因进行了系统发育分析。特别是在更深的层次上（例如，在家族层次和更深层次上在传统上公认的分歧），质体数据具有巨大的价值。最初的研究仅使用racL（编码RuBisCO的大亚基）；在一项具有里程碑意义的研究中，该研究显示了质体基因序列的实用性，由43位研究人员合作对499种植物进行了分析，为种子植物提供了第一个DNA系统发育框架。最近，新一代测序技术使完整质体基因组测序成为可能，并在所有绿色植物中组装了大型系统树；其他对质体位点的研究集中在绿色植物的主要分支上。质体系统进化学在过去150年中为我们对植物关系的理解带来了最根本的变化，揭示了绿色植物的主要分支，陆地植物的姊妹群，陆地植物之间的关系，并重塑了我们对苔藓，地钱，蕨类，裸子植物和被子植物系统发育的理解。这些研究不仅使人们对进化关系有了更清晰的了解，而且还促进了被子植物和蕨类植物的重要的新的分类；这些分类是突破性的分类，代表了与以前基于形态学发表的任何理论所发生的巨大变化。在某些情况下，质体基因组表现出足够的变异性，可用于群体水平的研究以及系统地理学分析，尽管在动物中无法通过mtDNA进行观察。长期以来人们一直认为杂交是植物进化的主要力量，但使用质体基因进行的分子研究表明，过去发生的许多未曾预料到的杂交事件显示杂交在植物中的发生率比人们想象的还要普遍，并伴随有成百上千的质体基因组渗入案例。我们当前的绿色植物系统发育关系的大多数框架都基于质体基因组序列数据，而当前的分类很大程度上基于质体基因系统发育。只有在过去几年中，随着核基因测序变得越来越常规，才产生了类似的核基因拓扑。重要的是，质体树和核树之间存在不一致，不仅在长期以来一直发现基因渐渗的浅层水平，而且在深层水平上也存在差异，这表明假定的古老网状结构。 对质体基因和基因组的研究还揭示了质体绿色植物类群的复杂历史，在其他谱系（包括褐藻，红藻和裸藻）中发生了次级和三级内共生事件（代表光合绿藻或红藻的捕获） 。总之，来自绿色植物系统发育和光合真核生物其他类群的越来越多的质体基因和基因组集合提供了序列信息和资源，不仅可用于追踪植物进化，而且还用于叶绿体遗传工程。 在系统发育分析中，能够使用整个质体基因组，或至少大部分~80%的蛋白质编码基因，以及典型的被子植物质体组的4个tRNA基因的技术创新，仍然对基因组本身的进化具有指导意义。尽管长期以来就是否，何时以及如何组合来自不同来源（分子和形态）或不同基因组（核和细胞器）的数据进行了争论，但在一次分析中将所有质体基因（可能具有不同的进化参数值）组合在一起，已获得普遍共识，因为这些基因相互关联并代表一条染色体（也许被视为单个字符），所以大多数研究确实将质体基因整合到了一个分析中。然而，最近的证据显示，整个被子植物群体中和豆科植物中，由单个质体基因构建的系统发育树之间存在广泛的拓扑不一致。尽管质体基因树之间的差异可能是由于生物学原因引起的-例如质体，核和线粒体基因组之间的异质重组和基因转移-强烈的差异是出乎意料的，尤其是考虑到异质性很少，限制了重组的可能性。在经验层面上，对导致观察到的不一致质体基因树的因素还没有很好地理解，需要对异质和基因组间转移进行更多的研究，尽管迄今为止的结果表明了随机和系统的误差，后者是由于系统发育分析中使用的进化模型的不确定而产生的。无论基因树差异的原因是什么，质体基因如果整合成一个单一的分析，可能会混淆多个系统发育信号，混淆拓扑和分支长度的总体推断，从而对发散时间、多样化、特征进化等下游分析产生影响；因此，在今后的研究中需要更多地探索质体基因树。在20世纪80年代转基因革命的黎明，利用农杆菌介导的转化将抗除草剂基因引入核基因组，并通过花粉逃逸的可能性，受到了公开的辩论。另一个主要问题是昆虫对通过核基因组在低表达水平的植物中产生的细菌杀虫(Bt)蛋白的抗药性的发展。因此，叶绿体基因工程的概念首先在分离的叶绿体中得到证实，目的是将叶绿体重新引入原生质体以再生转质体细胞系。但是，康奈尔大学的John Sanford发明了基因枪，因此无需进行后续步骤，并促进了将外源DNA直接引入植物细胞的叶绿体中。在对叶绿体中外源基因表达进行了30年研究之后，> 75％的外源基因使用了首次报告中使用的psbA调控序列。尽管已经报道了几种将DNA传递到叶绿体中的方法，但是基因枪传递仍然是唯一可重现的方法。Goldschmidt-Clermont引入了第一个叶绿体选择标记基因-aadA基因，随后将其用于转化烟草叶绿体基因组和大多数其他农作物。虽然外源基因被引入转录沉默间隔区，但叶绿体基因组反向重复区的转录活性间隔区是由Daniell等人提出的，目前是转基因整合中使用最广泛的间隔区。叶绿体基因组已被改造用于表达来自细菌，真菌，原生动物或人类基因组的外源基因，以用于各种生物技术应用。令人惊讶的是，利用细菌调控序列表达了苏云金芽孢杆菌的细菌操纵子，并达到了报道的最高水平的Bt蛋白。小的人类基因（胰岛素）以很高的水平表达（最多可占叶片总蛋白的70％）。但是，当将大的人类基因引入叶绿体基因组时，翻译效果很差。因此，基于133个测序叶绿体基因组中表达最高的pabA基因的密码子使用，开发了一种新的密码子优化程序。密码子优化算法从天然的人凝血因子FVIIIHC中消除了105个稀有密码子，从而增强了表达。CTB-FVIII-LC基因的类似密码子优化导致最大的人血蛋白（FVIII，185 kDa单体，具有五聚体组装）在叶绿体中成功表达，目前已推进商业化生产和临床试验。密码子优化的Ace2现在已在临床上经过测试，可治疗COVID-19患者。 2018年全球酶市场价值为110亿美元;它用于食品/饮料（37％），清洁（26％），生物能源（15％）和动物饲料（13％）行业。对洗涤剂，纺织品和废水处理应用的需求不断增长，推动了酶行业的显着增长。酶现在被用作生物肥料和土壤增强剂，通过增强有益微生物来加速生长。碳水化合物酶是产品细分市场中的佼佼者，2018年市场份额为48％。在全球范围内，亚太地区工业酶需求（46亿美元）居首位，其次是欧洲（26.8亿美元），美国占最大的工业酶市场份额（38％）。 蜡和果胶会降低天然棉纤维的吸水率；与通常的理解相反，天然棉纤维不吸收水或染料。为了增强对化学品的吸收，使用了碱性pH值和其他条件，但这些条件在环境方面存在问题，因为它们会释放出有毒的废水。因此，果胶酶用于纺织品的生物精练，以提高棉纤维的吸水率，而不会引起纤维素的破坏。同样，脂肪酶也用于洗涤剂行业，以去除油渍或黄油渍。但是，目前的商用脂肪酶的性能受到碱性pH值或较高温度下的最小活性的限制（洗涤剂为碱性，洗衣机经常使用热水）。不幸的是，在巧克力，冰淇淋和番茄酱中发现了甘露聚糖，它们是最常见的布渍。甘露聚糖酶将不溶性甘露聚糖水解成水溶性的较小寡糖，从而促进去污。但是，目前的甘露聚糖酶产品在很宽的温度或pH范围内都没有活性。甘露聚糖酶还用于造纸和纸浆行业，生物乙醇生产，油气井增产，食品和饲料，保健食品和制药行业。内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶可用于增强颜色亮度和织物柔软度。这些酶可用于牛仔布的生物洗涤，生物石染和生物抛光，以从原纤维表面去除染料，而对织物的损害最小。纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶的鸡尾酒用于果汁的澄清，浓缩和降低粘度。 当前，工业酶是在微生物系统中生产的，这些系统价格昂贵并且依赖数十年的过程。建立发酵设施及其无污染维护是第一个挑战。从宿主细胞中纯化酶及其制剂以增加浓度，稳定性和冷藏/运输都是非常昂贵的。因此，PhylloZyme最近推出了几种在叶中制成并在叶绿体中表达的酶产品，以取代价格昂贵的微生物酶工艺。这是首次在叶片中生产商业投放的蛋白质产品的报告（图1）。叶果胶酶，内切葡聚糖酶，脂肪酶或甘露聚糖酶已通过23种商业微生物酶产品进行了验证，这些产品可用于纺织品（染料结合，去除，脱毛），洗涤剂（去污）或果汁工业（澄清）应用。大多数叶片酶在较宽的pH/温度范围内作为粗叶提取物起作用而不需要纯化，叶片酶可以在环境温度下作为冻干植物细胞储存几个月/年，而不丧失酶活性。商业生产的酶被广泛用于日常生活中，包括早晨的咖啡/果汁，白天穿着的纺织品（增强吸水率，染料结合力），洗碗/衣服（洗涤剂），晚间饮料（酒，啤酒）或消化食物（脂肪，碳水化合物）。当前，这些酶在发酵系统的酵母，真菌或细菌中产生。用于消化奶制品的β-葡萄糖苷酶的生命周期分析表明，每千克β-葡萄糖苷酶会从发酵中释放出52 kg的二氧化碳，以及18,140 kg的废水和> 15 kg的固体碎片和一氧化碳，甲烷和其他有毒气体，以及因清洁用于酶生产的发酵罐中使用的有毒化学物质而引起的环境压力。考虑到每天产生数百万吨的微生物生物量，处理全球CO2排放和有毒废水是一项重大的环境挑战。用叶酶代替发酵制成的酶，除了防止释放110公斤二氧化碳外，还可以捕获多达570公斤二氧化碳，每产生一公斤酶/蛋白质，净捕获680公斤二氧化碳，从而减少人为温室气体排放。价格低廉的叶绿体表达的蛋白质药物和疫苗-从实验室到诊所尽管诸如胰岛素之类的蛋白质药物挽救了数百万人的生命，但对于全球绝大多数人口而言，它们还是负担不起的。确实，胰岛素泵的价格在6,000美元至12,000美元之间，但全球人口的三分之一每天的收入不足2美元。因此，需要新的方法来更有效地生产和输送蛋白药物（PDs）。食用植物细胞提供了表达和口服PDs的机会。由于人类或动物酶不破坏植物细胞壁聚合物的β键，口服时，PDs在胃中受到保护，不受酶的消化。但是，当完整的植物细胞到达肠道时，肠道中共生微生物释放的酶会消化植物细胞壁，从而将PDs释放到肠道腔中。当标签与PDs融合时，它们穿过肠道上皮并到达循环系统或免疫系统（图2）。因此，在几种动物模型中，莴苣叶绿体中表达的PDs的口服给药已被开发用于治疗传染性或遗传性疾病，目前已进入临床。最近的进展包括通过去除抗生素抗性基因在无标记叶绿体基因组中表达PDs，在cGMP设备中生产莴苣中表达的PDs，通过毒理学和药代动力学研究评估药物以及最近FDA批准通过口服花生细胞治疗的PD过敏。在开发SARS-CoV-2疫苗或治疗COVID-19患者的急性/致死性肺/心力衰竭下有所应用（图2）。
图1：叶绿体和微生物酶对染料或染色去除、吸水或果汁澄清的比较。
图2：口服莴苣叶绿体中制成的蛋白质药物。 原文链接： https://onlinelibrary./doi/abs/10.1111/pbi.13556
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