博士解读｜肿瘤由“冷”转“热”的新方式——Gasdermin E诱发细胞焦亡激活抗肿瘤免疫

导读

细胞焦亡（pyroptosis）是一种炎症性的死亡方式，Gasdermin蛋白家族则被鉴定为细胞焦亡的关键执行分子。Gasdermin被切割后，其N端结构域聚合并在细胞膜上形成孔状结构，导致细胞崩解，并诱发强烈的炎症反应。肿瘤细胞焦亡过程中，Gasdermin家族能够被活化的Caspase-3切割激活，导致肿瘤细胞从非炎性的凋亡转向发生炎性的焦亡[1]。

既往研究表明，在很多肿瘤细胞系和肿瘤组织中，Gasdermin E（GSDME）启动子常发生高度甲基化导致其低表达；同时，GSDME能抑制胃癌细胞克隆形成和增殖能力。另外，GSDME低表达的乳腺癌患者预后更差，转移更多。这些研究提示GSDME是抑癌基因。作者猜想，肿瘤细胞中的GSDME蛋白是是否通过影响肿瘤浸润性的免疫细胞而发挥抑癌作用呢？其间具体的分子机制又是怎样的？

本文的通讯作者是来自美国科学院院士、哈佛大学分子医学系主任Judy Lieberman教授。这位教授致力于研究T细胞在抗病原体免疫和肿瘤免疫中发挥的作用。近年来，Lieberman教授在细胞焦亡与肿瘤免疫领域进行了深入的探究，。本文于2020年发表Nature杂志上，题目为Gasdermin E suppresses tumour growth by activating anti-tumour immunity，在其中，作者讲述了肿瘤细胞焦亡对肿瘤免疫中的促进作用，为我们对肿瘤微环境中细胞焦亡和肿瘤免疫的联系提供了最新的认识[2]。

作者首先选取了GSDME表达缺失的肿瘤细胞系，再此基础上转入GSDME，并使用Raptinal（快速Caspase-3激活剂）诱导细胞焦亡。结果显示，GSDME表达的肿瘤细胞在Raptinal处理后转而发生焦亡，GSDME缺失的肿瘤细胞则发生凋亡。因此，GSDME的存在能够使Caspase-3激活下肿瘤细胞焦亡，而非凋亡。这也验证了北京生命科学研究所邵峰院士在2017年Nature文中的结论[1]。（如下图所示，表达mGSDME蛋白的肿瘤细胞呈“吹大泡”式的死亡形态，是焦亡所特有的，伴随非膜通透性的死细胞核酸染料快速染色；而GSDME缺失的肿瘤细胞呈现细胞固缩、膜空泡化，是经典的凋亡形态，死细胞染料早期难以着色。）

假设GSDME是抑癌基因，那么GSDME表达的肿瘤中是否伴随GSDME的失活突变呢？作者在TCGA数据库寻找GSDME的点突变，并且这些突变点都在Caspase-3切割点的附近。功能学实验显示，在这些肿瘤相关的GSDME突变大多能够导致GSDME失活，进而导致焦亡的发生，而靠近细胞膜结合部位和蛋白寡聚结合部位的突变的更倾向抑制焦亡。可见，在肿瘤患者组织中，肿瘤常发生GSDME失活突变，导致肿瘤细胞焦亡发生障碍。（下图所示，NT270为模拟切割后具有寡居成孔的GSDME活性片段，可诱发焦亡；GSDME-FL为GSDME全程，右侧所示为NT270片段基础上作肿瘤相关突变点的克隆。LDH释放比例提示焦亡发生）

接下来，作者想要探讨GSDME对肿瘤微环境发挥影响。在2017年，作者曾报道，F2A突变能够导致GSDME不能形成孔状结构而失活[3]。作者选取GSDME缺失的鼠源乳腺癌4T1细胞系，分别过表达野生型和失活型(F2A)的GSDME，并进行体内实验，结果显示，肿瘤中野生型GSDME的表达能够抑制原发肿瘤的生长（下图a），并且促进CD8+T细胞、NK细胞的活性（下图b-c，GzmB为颗粒酶B，PFN为穿孔素，是杀伤细胞的活性标志）。

作者猜想，GSDME的抑癌活性可能是通过影响肿瘤微环境中的免疫细胞发挥作用的，并且依赖于GSDME的打孔活性。在免疫力正常的小鼠中，GSDME缺失的肿瘤细胞相较野生型生长显著增快（下图左）；而在杀伤性细胞（NK、T细胞）缺失的小鼠中，GSDME缺失相较野生型并不能显著增快肿瘤生长（下图右）。说明GSDME的抑癌作用依赖于体内的杀伤性细胞。

进一步通过中和性抗体去除小鼠体内的NK、CD8+T细胞，发现仅在同时去除NK、CD8+T细胞的情况下，才能使野生型和GSDME缺失型肿瘤细胞在小鼠体内的生长差异去除。说明GSDME的体内抑癌作用是通过NK细胞和CD8+T细胞实现的。也就是说，NK和CD8+T细胞同时参与介导了GSDME的抑癌作用。

以上实验说明，GSDME的抑癌作用依赖于两类杀伤细胞，作者猜想焦亡能够导致肿瘤的免疫原性死亡（immunogenic cell death，ICD）。ICD的金标准是对二次接种成瘤的机体保护性抑制作用，其原理是，首发的肿瘤发生ICD同时，诱发肿瘤产生免疫保护作用，在机体中形成免疫记忆（类似疫苗）（Galluzzi, L, Nat. Rev. Immunol., 2017）。

为了观察中焦亡过程中肿瘤细胞发生了ICD，作者将空载和GSDME过表达型B16肿瘤细胞先接种在小鼠左侧，10天后接种野生型B16在小鼠右侧，观察右侧肿瘤的生长。结果显示，相比首次接种空载型细胞，在首次接种GSDME的肿瘤细胞小鼠中，其体内二次成瘤的肿瘤细胞生长被显著地抑制。说明GSDME表达的肿瘤能够诱发ICD，使机体产生免疫性保护作用。也说明焦亡是一种免疫原性死亡。

为了观察体内的焦亡是否由杀伤型细胞造成的，作者在体外将NK细胞系（YT）和肿瘤细胞进行共培养，结果显示，GSDME表达的肿瘤细胞能够被NK细胞诱发焦亡，而空载的肿瘤细胞则在NK细胞作用下发生凋亡。（如下图，LDH释放提示焦亡发生，右侧提示共培养条件下肿瘤细胞死亡形态及死细胞核酸染料染色）

与NK细胞共培养后，进行免疫印迹分析，结果显示NK细胞的加入能够造成肿瘤细胞中GSDME的切割，并使肿瘤细胞上清中HMGB1显著增加（HMGB1的释放是ICD的重要指标）。

作者观察NK细胞造成GSDME剪切片段的大小，结果显示GSDME的切割产物大小都是相似的，说明NK细胞引起GSDME切割的位置和Caspase-3的切割位置相同。同时，使用Ca2+螯合剂EGTA（能够抑制细胞毒性颗粒释放和穿孔素）能够阻断NK细胞介导的焦亡；而Caspase-3的抑制剂zDEVD-fmk或广谱Caspase抑制剂zVAD-fmk仅能部分阻断NK细胞诱发的焦亡。这说明NK细胞引起肿瘤细胞焦亡除了Caspase-3切割作用外，还有其他机制能够引起GSDME的切割。

据以往的报道，颗粒酶同样具有蛋白酶活性，能够诱发Caspase非依赖的细胞死亡。作者猜想，除了Caspase-3能够切割GSDME外，颗粒酶是否能够在同样的位置切割GSDME，从而诱发细胞焦亡？作者在细胞裂解物中加入颗粒酶GzmA、GzmB，结果显示，GzmB能够在体外对GSDME进行切割。这种切割并不能被Caspase-3抑制剂抑制，且GSDME被Caspase-3切割点突变体D270A不能被切割，说明GzmB能够切割GSDME，且切割位点与Caspase-3位置相同。

最后，作者选取了GSDME内源表达的人源肿瘤细胞，加入穿孔素（PFN）和颗粒酶B(GzmB)融合蛋白处理，并检测细胞内GSDME的切割和细胞焦亡比例。结果显示，在PFN存在的情况下，GzmB加入细胞能够引起细胞内GSDME的切割（下图左），随后引起细胞焦亡（下图右）；而当细胞中的GSDME敲除后，PFN+GzmB不能引起焦亡（下图右）。

总结：

在本研究中，作者发现，在杀伤细胞（NK细胞和CD8+T细胞）存在的情况下，GSDME的表达使肿瘤细胞发生“炎性”焦亡而不是“非炎性”凋亡。而杀伤细胞诱发肿瘤发生焦亡的机制，除了Caspase-3介导的GSDME切割，还有颗粒酶B对GSDME的切割作用，从而诱发肿瘤细胞焦亡。作者提出，细胞焦亡是一种新的免疫原性死亡方式，而GSDME表达能够诱发肿瘤细胞发生焦亡，使肿瘤由“冷”转“热”，激活机体的抗肿瘤免疫。综上，靶向肿瘤细胞GSDME和肿瘤细胞焦亡可能是未来肿瘤免疫治疗的新方向。

参考文献：

1. Wang, Y. et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature547, 99–103 (2017)

2. Zhibin Zhang. et al. Gasdermin E suppresses tumour growth by activating anti-tumour immunity. Nature. 2020 Mar;579(7799):415-420.

3. Rogers, C. et al. Cleavage of DFNA5 by caspase-3 during apoptosis mediates progression to secondary necrotic/pyroptotic cell death. Nat. Commun. 8, 14128 (2017)

 文献解读者： 

李智玲 博士

中山大学肿瘤防治中心

朱孝峰课题组博士生