Cell Stem Cell | 胚胎单细胞转录组揭示胚胎发育中细胞命运决定过程

撰文：楠烟不可言

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亮点：

本文采用scRNA-seq数据的拟时分析来重建早期小鼠和人类胚胎发育的过程，使用带注释的胚胎的延时成像，提供了对整个人类发育过程中转录组学变化的综合、有序和连续分析。研究发现人类滋养层/内细胞团转录组在从B2到B3囊胚阶段的过渡期，即囊胚扩张之前发生分化。该研究确定了人类胚胎中谱系规范事件的精确时间，并确定了转录组学特征和细胞命运标记。

近日由南特大学Laurent David研究组在《cell stem cell》杂志上发表了一篇名为“Integrated pseudotime analysis of human pre-implantation embryo single-cell transcriptomes reveals the dynamics of lineage specification”的研究文章。生物学中的一个关键问题是细胞命运如何在早期人类胚胎中发生。目前的研究从发育时期得到的主要信息是胚胎形态的变化。伴随着胚胎的形态变化和生长，建立了多能干的外胚层细胞和滋养外胚层细胞。由于人类多能干细胞是在人类着床前发育过程中建立起来的，因此对人类早期胚胎发生的深入了解对多能干细胞的研究具有重要意义。人类着床前发育对生育治疗，特别是体外受精（IVF）也很重要。本研究明确了小鼠和人类早期胚胎发育过程中决定基因表达和细胞命运的精确动力学。研究将形态学分期与分子事件结合起来，突出了小鼠和人类胚胎的差异和相似性。此外研究还确定了标记EPI、TE和命运前进展的蛋白质。本文为研究人类早期发育过程中细胞命运决定提供了可能。

比较小鼠和人类发育的所面临的主要困难之一是两个不同物种的发育时间和每个发育阶段的特异性不同。人类胚胎的体外培养显示出培养时间和形态之间的差异。因此，对于人类胚胎的研究，生殖生物学家依赖于基于形态学的精确标准注释。对scRNA-seq数据进行拟时分析似乎是研究谱系规范和分级分子事件的一个好方法。研究使用Monocle2生成发育细胞的命运轨迹，并确定最有可能的路径，定义单个细胞的转录组学特征。根据转录组对细胞进行聚类以识别以识别干细胞模型的谱系特征。最后通过延时监测和透明带厚度测量明细分期，并根据临床标准分级，我们能够将胚胎形态与分子事件联系起来。

研究首先使用两个现有的数据集计算了小鼠植入前胚胎发育的拟时间，这些数据集涵盖了早期16细胞桑椹胚到90细胞期囊胚。从早期的32细胞桑椹胚和晚期的32细胞桑椹胚，占据了两个分支的ICM和TE命运之一。来自64-和90-细胞囊胚的细胞位于拟时间特定分支的尖端。Sox2、Cdx2和Sox17表达的富集可以分别鉴定EPI、TE和PrE分支。拟时分析可以重建小鼠胚胎早期发育过程中的发育路径，包括预期的TE/ICM分支点和EPI/PrE分支。建立了小鼠早期胚胎细胞的发育途径后，研究将重点转向人类胚胎，首先从桑椹胚到B5囊胚的150细胞中，首次生成了25个人类胚胎的scRNA序列数据，将其进行处理后形成了128个胚胎1751个细胞图谱。同小鼠的数据进行比较，结果发现在人类胚胎中，ICM细胞在胚泡形成后不久就与TE细胞在转录上不同，而在小鼠中，这种情况发生得更早（图1）。

研究的下一步是定义与每个细胞相关的谱系。拟时分析特别适合用于研究植入前胚胎发育的动态过程。研究使用WGCNA（加权基因共表达网络分析）鉴定与不同发育阶段和谱系相关的基因表达特征。基因模块的激活或抑制可以通过称为模块特征基因的基因表达值的线性组合来概括。为了精确定位转录组的同一性，研究使用UMAP（统一流形近似和投影）方法从二维缩减的基因模块中提取模块特征基因。最后根据它们在UMAP上的相对位置对细胞进行聚类。这包括8个主要的集群，表明了特定的谱系和阶段；我们将位于簇之间的细胞称为未定义的或“中间物”（intermediates）。研究结果分析强调了3个未指明的细胞簇，并根据拟时分析的进展将TE细胞细分为3个亚簇。基于此确定了植入前发育过程中的发育分子状态，并为早期人类胚胎的细胞命运谱系提供了一种替代的、精确的细胞注释。为了进一步分析人类植入前发育过程中基因表达的时间动态，研究人员将基因模块表达与UMAP获得的每个细胞簇相匹配。这揭示了以代表性基因命名的8个基因模块的独特行为，这些分析定义了不同的基因模块，其动态表达是早期人类胚胎发育的特征。簇内模块的动态表达模式和假时间决定了每个模块中基因的潜在作用。有些模块与命运无关，但反映了胚胎发育的整体变化（图2）

使用拟时分析结合胚胎的延时成像，表明人类空化后的胚胎细胞在转录上是不同的。为了完善这一结论，后续实验研究了每个胚胎的转录异质性，根据胚胎在假时间的位置对其进行聚类。属于每个胚胎的细胞只能属于一个簇。然后测量了每个簇的拟时扩散，这一数据反映了转录变异，并报告了与每个簇的胚胎相关的注释。例如，簇1跨越相对较短的伪时间距离，并且仅包含3-dpf胚胎。簇K3和K4具有最高的伪时距变化。有趣的是，K3簇主要包含4-dpf胚胎，这表明在人类桑椹胚中，一些细胞发育更快。在小鼠中，对转录相似细胞的RNA速度分析表明，细胞的速度趋向于ICM或TE。因此，在16细胞期，小鼠细胞偏向于TE或ICM，但转录组（mRNA）的差异主要在32细胞桑椹胚期可见。同样，人类细胞的RNA 速度分析表明，尽管具有相似的mRNA图谱，但在分支前假时间定位的未指定细胞已经偏向于ICM或TE命运，这与小鼠的研究结果一致。在UMAP簇B1/B2上投影速度矢量时可以观察到这一点。人类胚胎的异质性似乎是在桑椹胚期建立的，但内细胞和外细胞直到B3胚泡期才在转录上有区别（图3）。

桑椹胚期细胞的致密化需要建立顶基极性。为了改进拟时分析，实验研究了人类胚胎顶端-基底极性的建立。人类着床前发育期间ZO1和CDH1的免疫染色显示，桑椹胚期CDH1的基底外侧表达，随后ZO1的顶端募集。这支持了人类胚胎顶端-基底极性与分子事件相关的理论，类似于其他哺乳动物物种。在获得顶端-基底极性和致密性后，哺乳动物植入前发育中的一个重要事件是形成囊胚腔，这是由桑椹胚/早期囊胚阶段水通道蛋白的表达介导的。这些结果使研究人员能够将主要的形态发生事件，压实和空化，放在拟时分析的未指明分支上。因此，CDH1、ZO1和AQP3可作为识别人类胚胎分子进展的标志物（图4）。

目前，人类用于研究EPI/谱系前规范的标记数量有限。目前需要标记物使研究人员能够跟踪EPI或FAT前细胞的进展。利用综合转录分析，研究试图确定B5孵化囊胚发育的EPI标记。在转录因子中，研究人员将IFI16作为开发EPI的候选。我们分析了IFI16在B5胚胎中的表达，结果显示IFI16阳性染色仅限于ICM细胞，而GATA2在TE细胞中的表达则相反。IFI16在B2之前未检测到，在ICM细胞B4后检测到IFI16。这些结果与先前的转录分析一致，表明IFI16与EPI之间存在联系。转录组学分析的结果通过免疫荧光（IF）验证，支持人类的EPI/前特异性发生在B4（晚期）囊胚中，这与小鼠不同，后者在90细胞（早期）囊胚中建立了EPI和前特异性（图5）。

接下来研究试图破解TE分支中的成熟事件。由于其在TE分支的后期表达，因此感兴趣的转录因子为NR2F2，与扩张/孵化囊胚（B4及以后）发育阶段相对应。在B5囊胚中，如果显示NR2F2的核定位局限于极性TE细胞与EPI细胞并列，表达NANOG。研究结果发现NR2F2标志着B4扩张囊胚中成熟的TE并扩散到所有TE细胞。NR2F2 细胞的鉴定将引起许多关于极性TE与EPI和子宫内膜之间的双分子对话的假说（图6）。

总而言之，本研究利用scRNA-seq数据构建了连续的小鼠和人类胚胎着床前转录组图谱。将拟时分析与基因相关分析相结合，揭示了拟时分析各分支中与特定状态相关的几个基因模块的动态变化。这项研究研究提高了研究人员对人类谱系规范中发生的分子事件的理解，并提供了特定发育步骤的新标记

教授介绍

Laurent David，法国南特大学细胞生物学副教授，主导干细胞生物学和体外受精研究项目。研究领域是了解多能干细胞在体细胞重编程和植入前发育期间对多能性的调节。目标是使用创新的幼稚重编程方法来表征调节多能性建立的特定因素，并在人类植入前胚胎中验证实验的结果。

参考文献

1、Dimitri Meistermann, Alexandre Bruneau, Sophie Loubersac et al. Integratedpseudotime analysis of human pre-implantation embryo single-cell transcriptomesreveals the dynamics of lineage specification (2021).https://www./science/article/pii/S1934590921001855