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2019年8月22日，国际权威学术期刊《自然》（Nature，IF：43.07）在线发表了HRU中文版主编、北京大学第三医院乔杰院士团队与北京大学BIOPIC汤富酬研究员团队合作的研究成果（Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation）。该研究应用体外模拟人类胚胎着床培养体系，经过与高精度单细胞多组学测序技术相结合，首次阐述了人类胚胎着床过程（受精后第5~14天）基因表达调控网络和DNA甲基化动态变化规律，解析了围着床期胚胎发育的分子调控机制。这项研究围绕早期胚胎发育，探索围着床期胚胎发育的转录调控与DNA甲基化动态变化，促进了对人类早期胚胎发育及着床机制的认识，为临床上反复流产、胎儿畸形等疑难病例的诊治提供了新的理论依据。我们特别邀请乔杰院士团队，为大家介绍本研究的背景、主要研究结果以及研究的意义，分享这项工作背后的故事。 
人类胚胎发育起始于精卵结合，受精卵通过多次卵裂发育为由内细胞团和滋养层细胞组成的囊胚。人类囊胚着床一般发生在受精后的第5~7天，胚胎与子宫内膜黏附并逐渐侵入，才能继续发育形成胎儿。自然妊娠情况下，停育或流产的发生率高达20%以上。已造福数百万不孕患者的辅助生殖技术，成功率一直徘徊在40%左右，即使经过胚胎植入前遗传学检测，选择染色体正常的胚胎进行移植，仍然会有一半左右的胚胎着床失败或早期流产。发生上述问题最重要的原因就是早期胚胎的发育异常。既往对着床过程的研究通常是使用小鼠等模式生物进行。根据国际公认的“14天原则”，对人类胚胎的研究允许到受精后14天，但由于技术的限制，很难获得早期着床后（7~14天）的人类胚胎，人类围着床期胚胎发育的过程仍然是一个“黑匣子”，有待揭开其中的奥秘。我们课题组紧密围绕早期胚胎发育过程，致力于包括着床前胚胎在内的人类生殖系细胞发育过程中基因表达、表观遗传学调控特征和潜在的机制研究，先后建立了人类植入前胚胎和胎儿不同器官发育的基因表达或表观遗传图谱，在Cell、Nature等国际知名期刊发表了系列研究成果。2013年，结合单细胞转录组测序技术，绘制了人类着床前胚胎的高精度单细胞基因表达特征图谱（Nature Structural & Molecular Biology，2013）；2014年，合作课题组利用新发展的微量细胞DNA甲基化组测序技术系统解析了人类着床前胚胎发育过程中DNA甲基化组重编程动态特征（Nature，2014）；2015年，团队对人类多个发育阶段原始生殖细胞进行了深入系统地研究，发现人类原始生殖细胞的关键特征（Cell，2015）；2018年，利用单细胞DNA甲基化高通量测序技术在全基因组、单细胞水平解析了人类着床前胚胎发育的DNA甲基化组图谱（Nature Genetics，2018）。同年，借助单细胞多组学测序技术解析了人类着床前胚胎发育过程中DNA甲基化组和染色质状态组的重编程过程，以及染色质状态与DNA甲基化之间的相互关系（Nature Cell Biology，2018）。以上各项研究极大丰富了人们对于人类着床前胚胎与原始生殖细胞的基因表达和表观遗传调控规律的认知。在此基础上，本研究借助人类胚胎体外长时培养技术，模拟了人类胚胎的着床和早期着床后发育过程，合作团队利用单细胞组学技术系统解析了这一关键阶段调控胚胎细胞谱系分化的基因表达和表观遗传特征。首先，我们根据已报道的胚胎培养策略重现了胚胎形态学动态变化特征，结果显示胚胎在无母体组织参与下能发育至第12/14天，并逐渐呈现出特异性的形态学特征（图1）。图1 人类胚胎体外模拟着床生长过程（day6~12） 在证实了人类胚胎在囊胚后期逐渐具备体外自我重构与着床的能力后，我们发现围着床时期的胚胎基本维持了囊胚晚期的三个主要细胞谱系（上胚层、原始内胚层、滋养外胚层），各个谱系均逐渐呈现出各自独特的基因表达特征（图2），例如上胚层呈现出明确的多能性转变，原始内胚层则逐渐开始表达卵黄囊发育相关基因（例如CD44），而滋养外胚层则逐渐开始表达激素相关基因（例如CGB家族基因），以上特征均提示胚胎在这一关键发育阶段逐渐呈现出母胎连接预备状态。图2 人类围着床期胚胎的转录图谱与分子特征 与着床相关的滋养外胚层细胞特化成为合体滋养层和细胞滋养层两类亚群，前者逐渐表达与妊娠建立相关基因（如CGB家族基因）。研究还发现了新的合体滋养层细胞标志基因，如TCL6和TBX3（图3）。图3 滋养外胚层（TE）两类亚群的特征性基因表达谱 X染色体剂量平衡一直是发育生物学关注的焦点之一，X染色体失活（XCI）对于女性与男性之间X染色体基因表达剂量平衡具有重要意义。本研究发现雌性胚胎逐渐呈现出父源或母源X染色体随机失活趋势，但发育到12天的雌雄胚胎，X染色体剂量尚未达到平衡；另一方面，X染色体基因的表达量应与常染色体剂量平衡，需要通过上调雌性或雄性中的X染色体（XCU）来实现（图4）。在晚期胚胎单细胞中活跃的X染色体，需要上调至两倍的表达剂量，达到和常染色体两个拷贝同样的表达剂量（X染色体/常染色体的表达剂量比从1:2上调到2:2）。该研究发现，着床阶段，雌性和雄性胚胎细胞中均已启动X染色体上调，但尚未达到上调两倍的状态。图4 围着床时期胚胎的X染色体剂量动态变化过程 为进一步分析胚胎着床过程中的基因组甲基化特征，利用团队研发的单细胞多组学测序技术对三类主要细胞谱系的DNA甲基化进行了深度分析，结果显示，三类主要细胞谱系在着床前，具有相似的DNA甲基化模式；着床后，均发生了重新甲基化，迅速获得了各自独特的DNA甲基化特征，例如，多能性基因POU5F1和NANOG在第8天滋养外胚层细胞中被特异性甲基化，而上胚层和原始内胚层细胞则没有（图5）。这一结果表明，胚胎在着床过程中经历了表观遗传重编程，DNA甲基化参与了细胞命运决定。图5 三类主要谱系在围着床发育时期的 DNA甲基化水平动态变化过程 本研究主要从胚胎发育的过程出发，探讨了人类围着床期胚胎发育过程中的基因表达调控和DNA甲基化动态变化规律，研究内容与生殖医学和发育生物学密切相关，结果系统阐述了人类围着床期胚胎发育的过程。在投稿到《自然》杂志后，主编与审稿人对我们的研究表示出了浓厚的兴趣，认为该研究非常有意义，极大促进了对人类胚胎着床分子机制的认识。在补充大量试验、反复修改和讨论后，论文于2019年8月22日在线发表。 本研究较全面地揭示了围着床期胚胎主要细胞谱系基因表达调控网络。首次阐明了围着床期胚胎中X染色体失活与上调两种机制并存，调控早期胚胎中X染色体上基因表达剂量。进一步揭示了DNA甲基化调控关键基因的转录，对维持细胞命运与谱系分化具有重要作用。此项工作将人类早期胚胎分子机制的研究拓展到了围着床期的阶段，对研究早期胚胎发育及着床机制、探索着床失败的原因具有重要价值，为临床上早期流产、胎儿畸形等疑难病例的诊治提供了新的理论依据。本研究为优化体外着床体系，以及多能干细胞的分化与胚胎发育相关研究提供了重要依据。未来，我们课题组将在此基础上，进一步探讨人类体内和体外胚胎发育的具体差异、着床期胚胎与子宫内膜间的相互作用与关系、关键基因的功能和作用机制。对导致胚胎着床失败关键机制的探索和确定，将指导我们改善和发展相关的治疗方案，从而提高辅助生育技术的临床妊娠率。北京大学博士后周帆，博士生汪睿、袁鹏、任一昕、毛雨诺为该论文的并列第一作者，汤富酬教授和乔杰院士为论文的共同通讯作者。该项研究得到了北京市科学技术委员会、国家自然科学基金和国家重点研发计划的支持。本文由北京大学第三医院袁鹏、任一昕博士供稿 1. Zhou Fan, Wang Rui, Yuan Peng, Ren Yixin, Mao Yunuo, Li Rong, Lian Ying, Li Junsheng, Wen Lu, Yan Liying, Qiao Jie, Tang Fuchou. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature, 2019;572(7771): 660-664.
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