【原】用WES和RNA-Seq数据提取到的somatic SNVs不一致

学徒和学员已经陆续出师，是时候把生信技能树的舞台交给后辈了！

安排学员做了一个翻译

全外显子测序（WES）和RNA测序（RNA-Seq）是二代测序（NGS）的两个主要平台，其中WES主要用于发现DNA变异，而RNA-Seq的使用集中在基因表达量的测量，生信技能树jimmy老师B站都分享过这两方面数据的处理视频教程：

• 免费视频课程《RNA-seq数据分析》
• 免费视频课程《WES数据分析》

其实两者均可用于检测遗传变异，特别是在单核苷酸变异方面（SNVs）。如果大家对RNA-seq数据如何找变异位点的流程不是很清楚，可以看我们生信技能树以前的教程：

• 2017年6月:RNA-seq 检测变异之 GATK 最佳实践流程
• 2019年11月:最新版针对RNA-seq数据的GATK找变异流程

然而如何从WES和RNA-Seq中检测出突变的一致性尚未得到系统的评估。2015的一个文章在肿瘤病人里面做了这样的比较：Inconsistency and features of single nucleotide variants detected in whole exome sequencing versus transcriptome sequencing:  有意思的是引用情况非常糟糕，截止到目前（2020-09-05）都不到20个引用！

在这项研究中，Vanderbilt University医学部的研究人员使用27对肿瘤样本及其匹配的正常样本的WES和RNA-Seq数据，研究了SNV检测中技术和生物学上的不一致性。他们分析了三类SNVs：

• （1）仅在WES中检测到的
• （2）仅在RNA-Seq中检测到的
• （3）在两者中均检测到的。

他们发现在WES和RNA-Seq中检测到的SNVs有很小的重叠（约14%），仅在WES中检测到的SNVs主要由于其低覆盖度、低表达或它们位于RNA-Seq数据中的非转录链，而只在RNA-Seq中检测到的SNVs主要因其位置超出了WES检测边界（这一部分约占71%），以及区域覆盖度低、突变等位基因覆盖率低或RNA编辑。两种技术共享的SNVs在WES和RNA-Seq中都具有较高的基因座特异性覆盖度，并且具有较高的基因表达水平。

而WES和RNA-Seq各自特有的SNVs显示出不同的核苷酸替代模式，例如55%的RNA-Seq特有的突变是从A：T → G：C（RNA编辑的一个标志）。这项研究对WES和RNA-Seq数据中获得的somatic SNVs的不一致性提供了重要的评估。

 VarScan2读取 count值确定在仅在WES中检测中的 SNVs的原因。（A）堆叠柱状图展示了仅在 WES检测出的 SNVs的 RNA-Seq的 counts结果。（B）条形图展示了 RNA-Seq和 WES共同检测到的 SNVs的 counts结果。红色代表 counts值为 NA（没有覆盖），黄色代表 counts = 1，绿色代表 counts = 2-7，蓝色代表counts ≥ 8。大多数仅在WES中检测出的 SNVs不在 RNA-Seq中。 

O’Brien T D, Jia P, Xia J, et al. Inconsistency and features of single nucleotide variants detected in whole exome sequencing versus transcriptome sequencing: A case study in lung cancer[J]. Methods, 2015, 83: 118-127.

来源：https:///inconsistency-of-somatic-snvs-called-in-wes-and-rna-seq-data/

备注：

SNVs（单核苷酸变异）和SNPs（单核苷酸多态性）有所不同，SNPs既存在于肿瘤DNA中，也存在于对照DNA中，而 somatic SNV仅存在于肿瘤样本中。当然，更主流的描述其实是 germline和somatic的变异位点的描述。

学徒作业

现在提供WES和RNA-seq数据的队列研究非常多，如果大家有服务器，完全可以重复一下这篇文章的分析过程，做一下同样的比较！

很久以前，生信技能树分享过台湾OSCC癌症多组学，文章是 2016年10月年发表的：APOBEC3A is an oral cancer prognostic biomarker in Taiwanese carriers of an APOBEC deletion polymorphism  就是提供WES和RNA-seq数据

对外显子数据的分析

首先统计了50个OSCC病人的肿瘤癌旁配对全外显子数据的测序总览，走bwa+gatk流程，并且走mutect得到somatic mutations列表，经由 Oncotator 注释成maf文件。最终对着50个病人找到了24,051 somatic mutations 。

然后找拷贝数变异，使用的是 GATK DepthOfCOverage计算测序深度，再用exome CNV 判断拷贝数情况。

测序策略是PE100bp, (75-Mbp target region, mean depth = 244 ± 54×)，使用的测序仪和试剂盒是 HiSeq 2000 with the TruSeq PE Cluster kit v3 and TruSeq SBS kit v3

对转录组数据的分析

该实验共得到39对OSCC病人的肿瘤癌旁配对转录组数据，首先检查的测序总览。

然后走标准的转录组数据分析流程: Trimmomatic+hg19+STAR+RSEM+GENCODE

然后，定义了 3548个显著的差异表达基因，阈值是 *p-*value < 0.05 and fold change > 2 ，只保留  transcripts per million (TPM) larger than 0.5。

大家可以下载全部的数据，走Inconsistency and features of single nucleotide variants detected in whole exome sequencing versus transcriptome sequencing:提到的图表。