这篇8分 m6A预后模型有什么创新之处？

题目：m6A regulator-based methylation modification patterns characterized by distinct tumor microenvironment immune profiles in colon cancer

研究m6A调控因子的甲基化修饰模式在结肠癌肿瘤微环境免疫特征中的作用

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摘要

背景：最近的研究重点关注RNA m6A修饰在肿瘤发生和发展中的作用。然而，尚不清楚m6A修饰是否在肿瘤微环境（TME）形成和免疫调节中也具有潜在作用。

方法：本研究作者使用NMF算法对23个m6A调控因子进行一致性分子亚型分析，确定结肠癌（CC）中m6A修饰模式和m6A相关基因特征。使用ssGSEA和CIBERSORT算法研究免疫细胞的浸润情况。基于PCA算法的m6Sig打分模型评估具有免疫应答的m6A修饰模式。

结果：1307个CC样本中鉴定到3种不同的m6A修饰模式且均与不同的临床结果和生物学通路有关。TME特征表明m6A模式与immune-inflamed,immune-excluded和immune-desert这三种免疫特征有关。根据m6Sig打分将CC患者分为高打分组和低打分组，m6Sig打分较低患者的特点是生存时间较长且免疫浸润较强。进一步分析表明m6Sig打分较低的患者PD-L1表达水平和SMGs突变频率更高。此外，在免疫治疗队列中m6Sig打分较低的患者免疫反应和临床效果更好。

结论：本研究强调了m6A修饰与TME多样性和复杂性显著相关。研究m6A修饰模式可以加强对TME特征的理解并促进有效的免疫治疗策略。

流程图

结果

1. 数据的获取和整理

从GEO和TCGA数据库下载1307名CC患者的基因表达数据和临床数据，分别为GSE39582,GSE37892,GSE14333和TCGA-COAD。

2. 结肠癌中m6A调控因子的遗传变异

作者研究了结肠癌中23个m6A RNA甲基化调控因子的作用。图1A表明这些m6A调控因子的动态可逆过程可以识别，移除和添加m6A修饰位点并改变RNA剪接，RNA翻译和RNA降解等生物学过程。图1B为这23个m6A 调控因子的GO富集结果。在394个样本中，有120个样本发生了m6A调控因子的遗传突变，其中ZC3H13的突变频率最高（图1C）。此外，作者发现CNV突变频率较高，其中YTHDF1/3、IGF2BP1/2/3、KIAA1429和HNRNPA2B1发生CNV扩增而YTHDF2、YTHDC2、METTL14、RBM15和ZC3H13发生CNV缺失（图1D）。m6A调控因子在染色体上发生CNV突变的位置如图1E。PCA分析表明m6A调控因子可以显著区分正常样本和肿瘤样本（图1F）。进一步的分析表明，ALKBH5、METTL14、YTHDC2和YTHDF3在肿瘤样本中显著下调，而CBLL1、ELAVL1、HNRNPA2B1、HNRNPC、IGF2BP1、KIAA1429、LRPPRC、METTL3、RBM15和YTHDF1在肿瘤样本中显著上调(图1G)。以上结果表明，正常样本和肿瘤样本中m6A调控因子在基因组水平和转录水平上均存在显著差异。因此，m6A调控因子的表达水平变化和遗传变异对CC的发生发展起着重要的调节作用。

图1 结肠癌中m6A调控因子的遗传改变

3. 鉴定23个调控因子介导的m6A甲基化修饰模式

全面分析23个m6A调控因子的相互作用，调控因子连接和对CC患者的预后作用（图2A）。结果表明，m6A修饰模式中调控因子的相互作用起着关键作用并与癌症的发生和进展有关。作者使用NMF算法的一致性聚类分析对具有不同m6A修饰模式的样本进行分类，共鉴定到3类（图2B），分别命名为m6A-C1，m6A-C2和m6A-C3。其中m6A-C1具有显著的生存优势而m6A-C3预后较差。对TCGA-COAD队列进行相同的分析，结果与之一致（图2C）。

图2 m6A甲基化修饰模式和相关的生物学通路

4. m6A修饰模式的特征

为研究三种m6A修饰模式的行使的生物功能和参与的通路，进行GSVA富集分析（图2D）。此外，作者使用ssGSEA绘制聚类热图，以可视化不同m6A修饰模式下28个免疫浸润细胞亚群的相对丰度（图3A）。使用CIBERSORT研究免疫细胞浸润程度（图3B）。作者使用ESTIMATE算法进行免疫打分和评估肿瘤纯度，其中m6A-C1免疫打分最高，其次为m6A-C2和m6A-C3（图3C），然而m6A-C3的肿瘤纯度最高（图3C）。基于前人研究可以将CC患者分为4种亚型，CIN亚型主要聚集在m6A-C2和m6A-C3，而dMMR亚型主要聚集在m6A-C1（图3D）。此外，作者比较了三种m6A修饰模式中PD-L1的表达水平，m6A-C1中PD-L1显著上调（图3E）。以上结果表明三种m6A修饰模式具有不同的免疫浸润特征。

图3 m6A 修饰模式的TME特征

5. 结肠癌中m6A表型相关的DEGs

作者进一步研究了三种m6A修饰模式下结肠癌中m6A相关转录水平的潜在变化，通过经验贝叶斯方法确定三种m6A修饰模式中524个共有的DEGs（图4A）。GO分析表明与RNA修饰，转录和免疫调节相关的生物过程显著富集（图4B）。这些结果表明，这些共有的DEGs具有m6A修饰和免疫特征。基于这些基因进行非监督一致性聚类分析，共分为三个亚型，分别为m6A gene-S1, m6A-gene-S2和m6A gene-S3（图4C）。生存分析表明三个亚型具有显著的预后差异。m6A gene-S1与预后较好有关，而m6A gene-S3与生存期较短有关（图4D）。在考虑年龄、性别、MMR和分期后，m6A基因与生存期仍然具有显著的统计学相关性（图4E）。

图4 m6A相关的差异表达基因和功能注释

6. 构建m6Sig打分和临床相关性的研究

作者基于上述m6A相关特征基因开发了一个m6Sig打分模型，可以量化结肠癌患者的m6A修饰模式。图5A为m6Sig打分模型的流程图，其中CIN亚型的m6A gene-S2的m6Sig打分较高，而m6A gene-S1的m6Sig打分较低。通过Spearman分析m6Sig打分与生物学特征之间的相关性，结果表明m6Sig打分与免疫激活过程和DNA修复显著负相关，而与EMT和基质相关特征正相关（图5B）。根据m6Sig打分将患者分为高打分组和低打分组，低打分组预后较好（图5C）。此外，m6Sig打分与分子亚型之间的关系表明dMMR亚型的m6Sig打分低于其他亚型（图5D）。低打分组中PD-L1的表达水平较高（图5E）。

TCGA-COAD数据集的验证表明m6Sig打分低的患者生存期较长（图5F）。根据MSI状态将肿瘤分为4个亚型，MSI-H亚型的m6Sig打分较低（图5G）。肿瘤突变负荷分析表明，m6Sig打分低组的突变频率更高（图5H）。m6Sig打分低组体细胞拷贝数变异（SCNA）的频率更高（图5I）。作者进一步对m6Sig低打分组和高打分组的结肠癌样本进行显著突变基因（SMG）分析，其中PIK3CA和SMAD4在低打分组突变频率较高，而TP53在高打分组突变频率较高（图5J）。

图5 构建m6Sig打分模型和临床特征相关性

7. m6Sig打分在预测免疫治疗反应中的作用

m6Sig抵打分组中TIDE表达水平显著降低而IPS显著升高（图6A-6D）。这些结果表明了肿瘤m6A修饰模式在介导免疫应答中起着关键作用。由于m6Sig打分与免疫应答有很强的的相关性，作者接下来研究m6A修饰特征是否可以预测患者对ICI治疗的应答。在抗PD-1和抗CTLA-4队列中，m6Sig打分较低的患者均表现出显著的临床优势，生存期较长（图6E和6G）。m6Sig打分较低的患者ICI治疗效果较好（图6F和6H）。

图6 m6Sig打分预测免疫治疗反应

结论

本研究中作者基于23个m6A调控因子评估了1307个结肠癌样本中的m6A修饰模式，并研究这些修饰模式与TME细胞浸润的相关性。最终作者构建了m6Sig打分模型，可以预测结肠癌患者预后和对免疫治疗的反应。研究肿瘤的m6A修饰模式将有助于增加对TME浸润的认识并为免疫治疗效果提供重要的见解。但本文还存在一定限制，还需要引入新的调控因子和临床病理特征来优化模型的准确性。

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