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学科前沿：转录组测序在原核致病菌中的研究应用（1）｜文献科普
易点评 为了揭示原核生物独特的分子机制，转录测序目前已经成为原核生物分子机制研究领域的利器，通过转录组学探索环境胁迫、抗菌药物等对原核生物的影响机制在近年来已成为了一种普遍的研究方法。对原核生物的转录组研究最早应用于致病菌。下面这篇文章就是转录组测序在致病菌研究中的具体应用。文中的抗菌肽是一种很有前途的抗多药耐药性的替代药物。而DP7是一种人工设计的抗菌肽，具有广谱的抗菌活性和免疫调节作用。作者探究了DP7对多药耐药的铜绿假单胞菌的抗菌活性，以及其对生物膜感染的抗性，并利用转录组测序等方法初步探讨了其可能的抗菌机制。 研究背景 对抗生素产生耐药性是人类健康最大的威胁之一，目前，每年至少有700万人死于抗菌素耐药性(AMR)，而且病原菌在宿主体内的破坏了生物膜正常状态促进了AMR并导致严重的慢性感染，因此临床上迫切需要开发出新型抗耐药药物和与生物膜相关的抗感染药物。 抗菌肽DP7(VQWRIRVAVIRK)是一种广谱抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的抗菌肽，具有较低的细胞毒性和天然免疫激活能力，并与万古霉素和阿奇霉素具有协同作用，是目前最有希望替代抗生素的抗菌肽之一。本文研究了抗菌肽DP7对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性。结果表明，抗菌肽与万古霉素和阿奇霉素具有协同作用，具有较强的天然免疫激活能力，可有效抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌的感染。 在这些病原体中，铜绿假单胞菌是一种普遍存在的革兰氏阴性致病菌，由于其多样的表型和代谢模式，已成为临床感染最常见的致病菌之一。一旦铜绿假单胞菌入侵生物膜建立慢性感染，它就会经历一系列的适应过程，使MDR进一步复杂化，使原本难治的感染演变成威胁生命的疾病，特别是在患有遗传性疾病、囊性纤维化和其他免疫缺陷的患者中。然而，据我们所知，DP7抗铜绿假单胞菌感染的活性及其机制尚未被研究过。 本研究对DP7的抗铜绿假单胞菌活性进行了系统的研究，包括：(1)检测DP7对临床耐药性铜绿假单胞菌的抗菌活性；(2)检测DP7对铜绿假单胞菌的抗菌活性；(3)测定DP7在体内对急性感染和慢性生物膜感染的抗菌活性；(4)通过RNA-Seq和基因组测序确定DP7的潜在靶点；(5)构建抗DP7的PAO1菌株DP7R和潜在的靶基因突变菌株(gshA44和wbpJ139)，并对这些菌株的表型特征进行分析，初步探讨DP7的抗菌机制。 研究结果 DP7对耐药铜绿假单胞菌显示出抗菌活性 表1显示了铜绿假单胞菌的药敏结果(MIC值)。在104株临床分离菌株中，24株对抗生素敏感，19株对一种药物耐药，4株对两种药物耐药，57株多药耐药(对三种或三种以上抗生素耐药)。 DP7在临床肺炎治疗中的最低抑菌浓度(MIC值)。铜绿假单胞菌的MIC值为8~32mg/L，对PAO1、PA14和PAO1 mucA22的MIC值为16mg/L。值得注意的是，仅有6株(6/104，约5.8%)DP7的MIC达到最高(32mg/L)，其中约15.8%(3/19)为单耐药菌株，约5.3%(3/57)为多药耐药菌株。敏感株和耐药株对DP7的敏感性无明显差异(最常见的MIC值为16mg/L)，表明DP7对多药耐药铜绿假单胞菌具有广谱抗菌活性。时间-杀灭曲线表明，DP7的抗菌效果与其他常用抗生素不同。
DP7具有生物膜抑制活性达到抗体外铜绿假单胞菌的作用 体外抗菌活性测定表明，在64mg/L DP7浓度下，PAO1、DP7R、PA14和PAO1 mucA22的生物膜生物量分别下降了43%、52%、68%和51%(图1)。对于WT PAO1，随着DP7浓度的逐渐增加，生物膜中的活细胞数没有显著变化，而生物膜生物量的减少却表现出对DP7浓度的依赖性，表明DP7可能通过靶向特定的生物膜相关靶点而不是简单地杀灭细菌来抑制生物膜的形成。同时，对于高毒力菌株PA14，随着DP7浓度的增加，生物膜和浮游状态下的活细胞数逐渐减少，表明DP7对PA14具有有效的抗生物膜活性。值得注意的是，突变菌株gshA44和wbpJ139的生物膜生物量没有表现出对DP7的浓度依赖性效应，但在高浓度DP7作用下，生物膜中的活细胞数量增加。细菌细胞被生物膜中的胞外聚合物(EPSS)包裹和保护，是导致慢性感染性疾病对抗菌素治疗产生抵抗的主要因素。
图1 DP7的抑菌和抗生物膜活性 在急性感染中，DP7对PAO1感染的小鼠有明显的保护作用，在0.25、0.5和1 mg/kg剂量下，分别有30%、70%和50%的存活率(图2b)，同时不会引起明显的体重变化(图2a)。0.5 mg/kg DP7与20 mg/kg氨曲南产生作用相当。 在慢性生物膜感染的案例中，施加0.5 mg/kg DP7组的肺内细菌负荷控制在1%×104cfu/肺，而阴性对照组为1%×106cfu/肺(图2c)。在组织学检查中，PBS对照组可见严重的炎症结构损伤，包括但不限于管腔粘液渗出增加、上皮细胞排列紊乱、红细胞浸润和严重的肺泡充血，用DP7或氨曲南治疗组的肺组织结构未见明显损伤。值得注意的是，在DP7处理的小鼠中有更多的中性粒细胞聚集(图2d)。综上所述，DP7在铜绿假单胞菌慢性生物膜感染中具有一定的抗菌活性。
图2 DP7处理的PAO1转录分析 RNA-Seq分析显示，在DP7处理的PAO1中共有532个DEG，其中235个下调基因，297个上调基因。KEGG富集分析显示显著差异表达基因的主要功能涉及能量代谢、翻译和免疫系统， (图3a)。对44个下调的DEG和106个上调的DEG进行分析，发现共372个相互作用。代谢分析表明，DEG主要干扰III型分泌系统(III型SS)、生物聚合物运输、NADH代谢、ATP合成、翻译和LPS的生物合成及运输(图3b)。考虑到膜结构紊乱可能是DP7抗金黄色葡萄球菌的作用，作者在前期工作中选择了参与LPS生物合成和膜脂蛋白表达的4个基因，即exbD1、blc、fpvR和oprL。其中exbD1、blc和fpvR基因分别减少0.55、0.60和0.53(图3c)。exbD1和blc的表达结果与RNA-Seq一致。
图3 抗DP7的PAO1菌株DP7R的基因组序列分析 经过6个月的抗性筛选试验，获得了具有DP7抗性PAO1菌株DP7R(MIC=128 mg/L)。检测到DP7R的7个SNP(表2)，并经测序验证，它们影响以下基因/蛋白：mexE、PA2798、pmrB、wapG和wbpJ和PA4689。这些结果表明，在对DP7的适应性抗性培养中，这些突变参与了药物外排泵激活、LPS生物合成、膜蛋白和毒力作用等途径，这与RNA-Seq确定的干扰DP7的DEG是一致的。 DP7对细胞形态学的影响 通过电镜观察DP7对细胞形态的影响。在TEM分析中(图4)，未经处理的PAO1细胞显示出一个厚厚的、均匀的、略微透明的细胞壁，细胞中有中等大小的致密颗粒(图4a)。相反，抗DP7的PAO1菌株DP7R的细胞壁较厚，电子荧光边界模糊且较重(图4b)。经0.5%MIC(8mg/L，图4c)和1%MIC(16mg/L，图4d)DP7孵育1h后，PAO1的细胞壁出现不同程度的裂解和皱褶，胞质明显异常，部分细胞内膜和外膜完全消失。PAO1经1%MIC(128mg/L)HH2处理1h后也出现类似的现象。另外，在16mg/L DP7作用下，DP7R细胞形态完整，未见细胞溶解或结构异常，这与本研究中DP7或HH2处理的金黄色葡萄球菌细胞突起增厚，而DP7或HH2处理的金黄色葡萄球菌细胞壁出现裂隙和细胞溶解的透射电镜观察结果一致，说明DP7对金黄色葡萄球菌的细胞壁结构有进一步的靶向作用，即与DP7R株基因组测序中RNA-Seq和LPS相关SNP中LPS和外膜蛋白相关基因的下调是一致的。
图4 PAO1菌株DP7R、gshA44和wbpJ139的表型特征 根据对DP7处理菌株的RNA-Seq、SNP和细胞壁观察的结果，作者推测DP7的一个可能的抗菌靶点是细胞壁外膜中的LPS。为了验证这种可能性，在构建了生长速度低于WT PAO1(图5b)的抗DP7的PAO1菌株DP7R(图5a)后，作者试图对wbpJ、pmrB、wapG和GSHA基因中的四个相关SNP进行点突变(表2)。最后，成功构建了wbpJ(G139A)和GSHA(A44C)基因点突变的菌株swbpJ139和gshA44。
表型特征包括生物膜生物量和活细胞数、LPS产量、PCA产量和运动能力。不出所料，菌株DP7R、gshA44和wbpJ139的LPS产量分别比WT PAO1降低了36.0%、17.2%和33.9%(图5c)。相比之下，菌株gshA44和wbpJ139的PCA产量分别是WT PAO1的3.18倍和3.50倍，而DP7R和WT PAO1的PCA产量差异不显著(图5d)。DP7R、gshA44、wbpJ139和WT PAO1的运动能力无明显差异，而DP7R和wbpJ139的游动和成群运动能力明显不足，表现为菌落直径变小，没有扩张的不规则分枝模式，而gshA44的游动能力得到部分维持。
图5 尽管存在运动缺陷，但突变体gshA44和wbpJ139的PCA增加可能有助于DP7对其生物膜生物量的非浓度依赖性。虽然DP7在生物膜中具有耐药性，但这两个突变体在浮游状态下对DP7仍表现出药物敏感性(MIC=16 mg/L，与WT PAO1相同)。令人惊讶的是，随着DP7浓度的增加，PEG生物膜中的活细胞数量显著增加(图2b)。这些结果表明，铜绿假单胞菌的LPS可能是DP7的一个潜在靶点，因为它抑制了LPS相关的基因，降低了gshA44、wbpJ139和DP7R中LPS相关的SNP表达，并导致了电镜观察下细胞壁的破坏。作者的研究表明，DP7在急性和生物膜慢性病小鼠模型中对多药耐药铜绿假单胞菌和相关感染都有有效的抗菌活性，并为DP7可能参与干扰外膜LPS的MOA提供了研究思路。 研究结论 作者的研究工作证明了DP7是一种有效的抗耐药铜绿假单胞菌和生物膜相关慢性感染的抗菌剂，并概述了DP7可能的抗菌机制是通过与外膜上的LPS相互作用来实现的。作者的工作表明DP7可能是治疗耐多药铜绿假单胞菌和生物被膜相关慢性感染的一种有前途的候选药物。 |
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