【原】如何做好酶切实验？

　　一、DNA质量

　　▲DNA的质量是决定酶切效率的最重要的因素。通常在克隆时，如果反复优化酶切条件后，都不能实现完全酶切，最可能的原因就是质粒DNA的质量有问题；

　　▲DNA的质量检测通常有两个方法：首先OD260/280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主，最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA），否则意味着质粒DNA的质量不高，应该重新制备。

　　二、样品纯度

　　DNA中的杂质，如：氯仿、乙醇、SDS等，都会影响酶的活性。

　　一般采取以下措施：

　　▲纯化DNA；

　　▲加大酶用量；

　　▲延长酶催化反应的保温时间；

　　▲扩大反应体系（＞20ul）。

　　三、甲基化影响

　　从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况：

　　在进行转化时，通常使用C600、HB101、JM109等菌株，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意！另外，动物DNA中CG序列多为5mCG，植物DNA中CG及CNG序列多为5mCG和5mCNG。

　　四、反应温度

　　大部分酶的反应温度为37°C，从嗜热菌中分离出来的内切酶则有更高的要求温度，一般为50-65°C不等。

　　五、DNA分子结构

　　DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性有很大影响，某些限制性内切酶在切割超螺旋的质粒时需要的酶量比切割线性DNA时要高很多。

　　六、缓冲液

　　对于每一种酶都有相应的最佳缓冲液（不同公司的同一种buffer可以互换使用哦~），可保证几乎100%的酶活性，所以应选择合适的缓冲液，使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA才可实现最佳活性，在这种情况下，也相应有100X（如NEB公司）或10X（如Takara公司）的BSA，不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。

　　七、反应时间

　　▲对于酶切鉴定试验（加酶量0.5-1μl，反应体系10-20μl，质粒DNA量在50-200ng），反应时间2-4h（如果时间比较紧的话可以1-2h）；

　　▲对于酶切后用于胶回收（加酶量1-2μl，反应体系30-50μl，DNA量在500-2000ng），反应时间3-6h；

　　▲对于反应条件不是很合适的时候(如双酶切时有一个酶的反应buffer不是很合适或者酶切位点在线性DNA的末端)最长16h。

　　▲为防止Star活性的产生，应将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。同时如果酶切时间过长可能会导致基因被切碎。