【原】DNA酶切出现意外怎么应对？

　　▲可能原因❶：内切酶失活

　　▲推荐解决方案：

　　1.查看内切酶的有效期；

　　2.确保内切酶储存在-20℃，再低于此温度，内切酶活性可能受影响；

　　3.避免多次冻融（不超过3次），建议使用冰盒储存或取放内切酶；

　　4.勿将酶储存于无霜冰箱或冰箱开门处：

　　▲可能原因❷：酶切方案不佳

　　▲推荐解决方案：

　　1.按照内切酶供应商推荐的酶切方案及其所适用的DNA样本类型；

　　2.确保酶切反应中包含所需的添加物或酶辅因子（如DTT、Mg2+、ATP、活性腺苷甲硫胺酸）；

　　3.使用随酶提供的酶切缓冲液。双酶切时，按供应商的推荐，需考虑兼容性及其它所需反应条件；

　　4.按照供应商推荐的最适酶切温度进行酶切，双酶切时若两种内切酶最适温度不一致，按顺序先进行较低温度酶切，再进行较高温度酶切；

　　5.确保酶切过程中不会因蒸发而使酶切体积减小，否则会使盐浓度增高，从而可能降低酶的活性

　　▲可能原因❸：内切酶不恰当的稀释

　　▲推荐解决方案：

　　1.避免使用微量体积（<0.5μL）内切酶进行酶切，保证足量日常储备，确保每个反应所加酶量准确；

　　2.勿将内切酶稀释于水或10×反应缓冲液中；

　　▲可能原因❹：配制酶切体系不恰当

　　▲推荐解决方案：

　　1.在反应体系中最后加入内切酶，加入内切酶后轻弹混匀，确保内切酶不会因甘油密度而沉于管底；

　　▲可能原因❺：酶切反应混合液中甘油过多

　　▲推荐解决方案：

　　1.酶切反应混合液中甘油浓度应<5%，加入内切酶的量不超过总反应体积的1/10，尤其是对于双酶切；

　　2.避免因蒸发而使反应体积减小，从而导致甘油浓度增高；

　　▲可能原因❻：酶切DNA浓度不合适

　　▲推荐解决方案：

　　1.酶切反应混合液中DNA浓度的最佳范围为20-100 ng/µL；

　　▲可能原因❼：DNA污染

　　▲推荐解决方案：

　　1.通过离心柱纯化、酚氯仿抽提和乙醇沉淀去除残留的SDS、EDTA、蛋白、盐分、核酸酶，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀，以去除EDTA和盐分；

　　2.当酶切未经纯化的PCR产物时，PCR产物体积应不超过酶切总体积的1/3（如30 µL酶切总体积中PCR产物体积不超过10 µL）；

　　3.如果DNA是经硅膜或树脂纯化，需>10000×g离心10分钟已去除残余粒子；

　　▲可能原因❽：DNA中找不到内切酶识别序列

　　▲推荐解决方案：

　　1.重新检查DNA模板，或通过测序检查；

　　2.如果通过PCR引物引入酶切识别序列，确保引物序列包含酶切识别序列且5’端有4-8个保护碱基；

　　3.查看所用内切酶是否需要不止一个识别位点才能发挥完全活性，添加含识别序列的DNA寡核苷酸或亚精胺可提高那些至少需要两个识别位点内切酶的活性（如AarI、SfiI）；

　　▲可能原因❾：甲基化影响

　　▲推荐解决方案：

　　1.查看内切酶的甲基化敏感性。如果内切酶受识别序列甲基化影响，尝试用异裂酶或同裂酶替代（如MvaI替代EcoRII）；

　　2.为了避免DNA的甲基化，在dam–/dcm–型大肠杆菌中复制质粒；

　　3.如果内切酶需要识别序列甲基化才能发挥功能（如DpnI、SgeI），在dam+/dcm+型大肠杆菌中复制质粒；

　　▲可能原因❿：DNA结构影响

　　▲推荐解决方案：

　　1.对于超螺旋的质粒DNA，其酶切位点可能被包埋，使用经验证可消化完整质粒的内切酶，如有必要，适当加大酶用量（如每µg DNA 5-10 units酶）；

　　2.对于线性DNA而酶切位点临近末端，检查完全酶切所需的额外碱基；

　　3.如果在质粒多克隆位点内进行双酶切，检查酶切位点临近序列，是否具有进行完全酶切所需的碱基数量，如果距离太近，两种酶切可能会互相影响；

　　▲可能原因⓫：水中有杂质

　　▲推荐解决方案：

　　1.将水离心（10 min， 10000×g）以去除水中污染物；

　　2.做阴性酶切对照，以水代替酶以检测水中核酸酶和细菌污染物的影响；

　　3.推荐使用新鲜的无核酸酶、分子生物学级别的商品化水；

　　出现预期外的酶切条带

　　▲可能原因①：内切酶星号活性

　　▲推荐解决方案：

　　1.酶用量不要超过推荐用量，如有必要可适当减少酶用量；

　　2.避免过度长时间酶切；

　　3.使用推荐的反应缓冲液。低盐、不合适的PH、除了Mg2+外的二价阳离子可能引起星号活性；

　　4.确保酶切反应中甘油浓度不超过5%；

　　5.避免因蒸发而使反应体积减小，进而增大甘油浓度和盐浓度；

　　▲可能原因②：其它内切酶污染

　　▲推荐解决方案：

　　1.使用一管新酶或新缓冲液，不恰当的实验操作可能使内切酶或缓冲液被另一种内切酶污染；

　　▲可能原因③：其它DNA污染

　　▲推荐解决方案：

　　1.重新制备新的样本DNA；

　　出现弥散的DNA条带

　　▲可能原因❶：DNA质量差

　　▲推荐解决方案：

　　1.通过电泳检测未酶切的DNA，如观察到降解则重新纯化DNA；

　　▲可能原因❷：试剂污染

　　▲推荐解决方案：

　　1.如有必要，制备新的试剂，使用新的内切酶或者重新纯化DNA，不恰当的操作可能使反应组分被核酸酶污染；

　　▲可能原因❸：DNA迁移缓慢

　　▲推荐解决方案：

　　1.在电泳前加入含0.2% SDS上样缓冲液后，将酶切DNA在65℃加热10分钟，可使与底物DNA仍结合的酶分离；