|
重复介绍一下复发性流产的临床界定 复发性自然流产（RSA）是指临床上连续2次或2次以上的自然流产（包括：多次生化妊娠、空孕囊、无胎心、胎心消失等），是一种常见的妊娠并发症，发生率占妊娠总数的0.4%～0.8%。RSA 中约有40%～80%临床上找不到明确病因，称为不明原因反复自然流产。 反复种植失败的定义并没有统一的标准，大家比较认同的定义为：重复IVF治疗超过 3个移植周期；或者累计移植≥10个高评分胚胎未能怀孕者；或者各中心自定义移植胚胎数目。由于近年来单胚胎移植和囊胚培养技术普及，过去的标准显然不适用了，因此有人提出以胚胎计算的标准，如累计移植4枚高评分胚胎，或2枚囊胚仍然不能怀孕者。 为什么反复重植失败要做PGS 复发性流产和反复种植失败的己知原因可分为染色体异常、子宫结构异常、内分泌异常、免疫功能异常、感染因素、遗传性凝血异常及环境因素。不明原因的复发性流产严重影响患者夫妇的生理及心理健康，是生殖医学的难题。其潜在的原因复杂多变，目前认为母胎界面异常、免疫因素等都是其可能的原因。另外,胎儿染色体异常为不明原因复发性流产的重要因素之一，尤其是对于前几次流产未行绒毛检测患者或者高育龄且符合助孕指征的患者来说PGS是必要的，可以从胚胎学角度减少复发性流产的发生。 PGD和PGS概念的简介介绍 PGD是指在体外受精过程中，对具有遗传病风险患者的胚胎进行种植前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法，可有效地防止遗传病患儿的出生。PGS 是指胚胎植入之前，采用与PGD相同的技术手段对胚胎染色体的非整倍性进行检测，分析胚胎是否有染色体数目和结构异常的一种早期产前筛查方法。
PGD和 PGS属于产前诊断的一种方式，其发其在其他诊断的最早阶段，避免了以往产前诊断方式可能的治疗性引产给母体带来精神和身体上的创伤，受到了广大生殖领域和遗传领域专家们的关注。 由于目前复发流产的患者不断增多，本文主要对本中心所采用的PGS诊断技术进行详细解释 卵胞浆内单精子显微注射技术（ICSI） 控制性超促排卵：根据患者情况选择合适的促排卵方案，包括长方案、短方案、超短方案、超长方案、措抗剂方案、自然周期与微刺激方案； 取卵：于注射人绒毛膜促性腺激素36小时左右手术室经阴道超声引导下取卵；
体外受精（ICSI）：取卵后4~6小时进行卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）。ICSI前卵子需在透明质酸酶中剥离颗粒细胞，脱颗粒一般在取卵后2~4小时进行。ICSI受精后，16~18h后根据原核及第二极体的数目检查受精的情况。 ICSI具体过程如下： （1）在显微针固定管内装上显微注射针和持针，在10×物镜下，使显微注射针和持针对齐。显微注射针与培养皿底平行或尖端稍朝下；（2）将卵子放入ICSI操作皿中的卵子滴中，1个卵子/每滴；（3）将ICSI操作皿放于显微镜上，将显微注射针放入PVP滴中，平衡压力后，移入培养液长滴边沿吸入活动精子，再移回PVP滴中释放出来，在40×物镜下，寻找正常形态精子制动，制动过程为：将显微注射针尖端抬高，置于精子尾部中上1/3处上方，压住精子使其不能前行，将显微注射针尖端快速滑过精子尾部。有时需要多次制动。（4）将已制动精子吸入显微注射针，尾部先吸入，精子置于显微注射针的尖端，将显微注射针移到卵子滴。（5）在卵子滴内找到卵子，将成熟卵子用显微持针吸住，第一极体位于6或12点的位置。卵子应靠在操作皿的底部，这样注射时可有支持。（6）将显微注射针的尖端和卵子边缘同时清楚聚焦，使它们在同一平面。选择3点钟方位注射精子，将精子尽可能移至显微注射针的尖端，以减少进入卵子的PVP。（7）将显微注射针的尖端刺过透明带和卵细胞膜，显微注射针尖端进入卵子直径的1/2-3/4处。吸取卵胞浆进入显微注射针，当出现胞浆突然快速通过显微注射针（表明卵膜吸破）时，停止吸入。缓慢将吐出的卵浆和精子注入卵子内，退出显微注射针。（8）按序注射所有成熟卵子，每个卵子在洗涤皿中洗涤后，依次放入培养皿中的培养微滴中，置于CO2培养箱中培养。 胚胎培养：胚胎用培养液微滴法进行培养。前二天采用生长培养液G-1.5+5%HSA，第三天则更换生长培养液G-2.5+5%HSA。对受精情况，胚胎生长情况，囊胚生长情况进行评价，选择合适的胚胎或囊胚进行活检。 胚胎评级 2PN 评级：根据合子中原核内核仁的大小、数量及其与合子中心区位置关系，将其分为Z1、Z2、Z3、Z4。Z1：原核等大紧挨，核仁大，数量等多，沿相邻缘排列，核周晕明显；Z2：原核等大紧挨，核仁大，数量等多，核仁散在排列，核周晕较明显；Z3：原核等大紧挨，核仁不等大，数量不等多，核仁一侧排列、另一侧散在，核周晕不明显；Z4：原核不等大或有距离，核仁小，大小不一致，核仁排列杂乱，无核周晕。 胚胎评级：根据卵裂球数目、形态和胞浆碎片等参数将胚胎分为4级。1级胚胎为细胞数8~10，卵裂球大小均匀，胞浆碎片小于10%，无多核，无空泡；2级胚胎为细胞数大于10或6~7之间，卵裂球大小均匀或只有一个不均，胞浆碎片小于15%，无多核，无空泡；3级胚胎为细胞数4~5，卵裂球大小不均数小于等于2，胞浆碎片小于20%，无多核，空泡无或较少；4级胚胎为细胞数2~3，卵裂球大小不均数大于等于3，胞浆碎片大于20%，有多12核，有空泡。2级及其以上为优质胚胎，3级及其以上为可用胚胎，4级为废弃胚胎。 囊胚评级：采用Gardner评分法。首先根据囊胚的扩张和孵出状态评为1~6级。1级为早期囊胚，特点是囊腔的体积小于胚胎的l/2；2级囊胚，其特点为囊腔的体积大于胚胎的l/2；3级为完全囊胚，其整个胚胎被囊腔充满；4级为扩张期囊胚，囊腔继续扩张，胚胎直径变大，透明带与原来比变薄；5级为正在孵出的囊胚，此时囊胚从透明带中部分孵出；6级为已孵出的囊胚，此时囊胚从透明带中完全孵出。囊胚评级同时参考内细胞团（ICM）和滋养外胚层。内细胞团包裹紧密，有很多细胞，则为A级；细胞较分散，仅有少数的细胞则为B级；有很少量的细胞则为C级。滋养外胚层若有很多细胞形成连续的上皮则评为A级；若由较少的细胞形成疏松的上皮则为B级；若仅有很少的几个大细胞则评为C级。 胚胎活检：目前较为常用的活检方法为采取的为激光法进行透明带去除并取材。卵裂期活检是从第3天卵裂期的胚胎中获取1~2个的卵裂球；囊胚期活检采用的方法是，在第三天胚胎透明带上打一个小洞，然后继续培养以便一些滋养外胚层细胞能够长出来，在第五天进行活检，囊胚活检通常能获得5~10个细胞。 胚胎植入前遗传学筛查技术 由于本中心与华大基因合作采用高通量测序对胚胎进行植入前遗传学筛查，胚胎植入前遗传学筛查最大的特点便是进行单细胞测序，所以本文主要对单细胞高通量测序在胚胎植入前遗传学筛查中的应用进行简单介绍：
单细胞全基因组扩增（sigma 试剂盒, DOP-PCR 技术原理） 单细胞裂解：（1）分离单细胞，PBS 溶解，置于 200uLPCR 管中。（2）加水至终体积 9uL。（3）准备细胞裂解缓冲液：2uL蛋白酶K溶于32ul 10*单细胞裂解液中，振荡至彻底混匀。（4）向步骤（2）单细胞样品中加入 1uL新鲜制备好的细胞裂解缓冲液，混匀。（5）上一步骤得到的混合液孵育：50℃1h，99℃4min（需精确），置冰上冷却，离心。 文库制备：（1）孵育后的产物中加入2ul1*single cell Library Preparation Buffer。（2）再加入 1uL library stabilization solution. （3）混匀，95℃ 2min。（4）置冰上冷却，离心，再置于冰上。（5）加入1uL libraryPreparation Enzyme，混匀并短暂离心。（6）加热样品：16℃20min，24℃20min，37℃20min，75℃5min，4℃维持。（7）从加热仪上取下样品，立即扩增或者-20℃保存3天。 扩增：（1）向以上反应产物中加入以下试剂：7.5uL 的10*Amplification Master Mix，48.5uL的Water Molecular Biology Reagent，5.0uL 的 WGA DNA Polymerae。（2）混合均匀，离心，然后开始热循环：95℃3min 和 94℃30s 共25个循环周期，然后 65℃5min，随后放置在 4℃中维持，反应完成后，-20℃保存。 扩增产物浓度检测：使用QubitFluorometer检测定量，DNA总量不低于0.5μg，才能进行下一步的测序。 扩增产物完整性检测：使用1%琼脂糖凝胶电泳，加入试剂盒Controllane进行判断，135V，40min。观察样本电泳条带大小范围（条带下限在250bp以上且上限不小于1000bp）视为完整。 高通量测序（high-throughput sequencing） 待测片段与微球体连接：（1）细胞的 mRNA 在生物素标记的寡核苷酸引物作用下反转录合成为 cDNA双链。（2）在 DpnⅡ限制性内切酶作用下使cDNA 双链片段化，在标记的生物素作用下纯化。（3）将纯化后的 cDNA 片段与载体（含有32 bp 序列标签）相连，利用序列标签上的 PCR 引物扩增 cDNA 片段。（4）cDNA 模板制备：利用酶切作用制备成 cDNA片段与 32 bp 标签相连接的线性片段。（5）cDNA 模板与微球体（直径为 5μm）相连。 cDNA 序列测定：（1）消化结合在微球体上的 cDNA 模板：消化成含有 4 个碱基末端的 cDNA模板（ⅡS 型限制性酶 BbvⅠ能够在距离识别位点第 9 和 13 个碱基的位置分别切割 cDNA 双链）。（2）洗去寡核苷酸连接接头。（3）将含有 4 个碱基末端的 cDNA 模板进行序列测定，通过荧光显微照片可以读出 cDNA 模板的序列。 结果判读：华大基因进行的高通量测序能够检测出基因片段＞1Mb的缺失重复，但认为染色体数目异常或者缺失、重复＞16Mb 为染色体异常。 我中心采用基于高通量测序技术的PGS对体外受精的胚胎进行染色体检测，挑选染色体正常的胚胎植入到子宫，以提高试管婴儿的成功率，使更多的不孕不育患者受惠于此，特别是在目前中国二孩政策的前提下，对于降低出生缺陷，提高中国优生优育水平起到关键作用，可以降低老百姓生育缺陷儿的痛苦，提高中国人口质量。
|
|
|
