五一劳动节，连续五天，在钉钉群直播互动授课带领大家系统性掌握cytoscape软件的使用方法和技巧，课程已经结束啦。文末有录播回放学习方式，以及配套授课资料！
一、iRegulon插件 基因调控网络通过调节基因的表达量和时间-空间分布特征影响生物发育，维持内稳态和疾病发生发展。因此，明确基因调控网络的拓扑学原理有助于对机制深入探讨。**基因调控网络由转录因子与其直接靶基因之间的相互作用组成。**每一种调控相互作用都代表着转录因子与靶基因附近特定DNA结合位点。
在这里，我们提出一个计算方法，称为iRegulon，以识别目标基因的重要调控因子 。
iRegulon插件主要使用近10000个TF motifs数据库和1000个ChIP-seq数据集或“tracks”来检测富集的TF motifs或ChIPseq峰。接下来，它将富集的TF motifs和“tracks”与靶点基因联系起来。iRegulon作为一个Cytoscape插件，支持 人类、小鼠和果蝇基因 。（可理解成tracks是和motifs差不多的数据库）
我们先了解下一些基本概念~
DNA→mRNA→蛋白质是典型的中心法则之一。而DNA转录的开始就需要转录因子的参与。从定义上来说，转录因子是一群能与基因5'端上游特定的序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的方式转录翻译成蛋白质 。
转录因子的本质是与DNA特异性结合的一系列蛋白质 。一般有不同的功能区域，如DNA结合结构域与效应结构域
DNA-binding domain（DBD） : DNA结合结构域。负责结合基因组调控区的DNA序列Effector Domain（s） ：调控效应区结构域。与转录因子结合的DNA片段 ，长度通常在5~20 bp范围内，一个转录因子往往同时调控若干个基因，而它在不同基因上的结合位点具有一定的保守性，又不完全相同。 转录调控通常需要多个转录因子的合作 , 它们的TFBS之间距离较近 , 组成相应的“顺式调控模块” motif: recurring pattern. eg, sequence motif, structure motif or network motif
DNA sequence motif: short, recurring patterns in DNA that are presumed to have a biological function
从上边的定义可以看出，其实motif这个单词就是形容一种反复出现的模式 ，而序列motif往往是DNA上的反复出现的模式，并被假设拥有生物学功能。
我们使用术语”motif”或“pattern”在模型的意义上代表一个TF结合位点的特异性，而且，经常是一些具有序列特异性的蛋白的结合位点（如，转录因子）或者是涉及到重要生物过程的（如，RNA 起始，RNA 终止， RNA 剪切等等）
通过motif 序列，我们可以研究相应转录因子的功能，预测潜在的结合位点等等，因而搜索、计算出motif，成为转录因子研究的重要一步
第一步是排序 ，根据PWM库（PWM is a matrix representation of a regulatory motif）对22284个人基因进行排序，对每个基因，我们用隐马可夫模型（Hidden Markov Model）搜寻转录起始点(TSS)附近（如500bp,20kb或10kb）的区域的 顺式调控模块(CRM)
如果从N个PWM库开始，就可以建立N个基因排序，每个基因排序都把最有可能的目标基因的motif排在最前面。然后在10种其它同源物种 中重复上述工作，每个PWM的最终排序就通过这10个物种的综合排序获得。
这里有两种PWM库，一个是6K库，一个是10K库 。这些库包含来自不同物种的PWM，以及没与TF对应的PWM。最终结果得到一个SQLite数据库，这个库里包含有N个基因排序。
第二步：回收。需要 共表达基因 作为输入信息。就是探讨这些基因在哪些PWM所对应的基因排序中富集 ，具体可以用AUC来表示。AUC 通过计算前3%(默认值，对应FDR在3%-9%)基因里包含多少比例的共表达基因来表示今天我举的例子是利用插件的常用情况：如何预测靶基因的转录因子？？
打开Apps--iRegulon--Predict regulators and targets Number of selected genes: 所预测的基因数目 Type of search space: 基于基因 Motif collection: 10k / 6k Track collection: 1120 ChIP-seq/ 750 Putative regulatory region：起始位点上下游端 Motif / Track rankings database: 排序所根据的数据库 结果主要分三个部分：Motifs，Tracks，Transcription Factors
会在cytosacpe右侧面板出现结果。先选择Motifs **Enriched Motif ID：**特征序列ID、 **NES：**根据PWM库富集出来计算得分。类似匹配程度 **AUC：**基因里包含多少比例的共表达基因来表示 ClusterCode ： 聚类（根据相似的Motifs）如选择第三行后，出现下方的内容
每个字母的高度与该位置的相应碱基的出现频率成正比，常以bits为单位 **Transcription Factor：**转录因子 **orthologous identification：**同源性 Motif Simialrity : Motif 间相似性Motif 和 Tracks 应该是两个类似的求TF的数据库，出来的结果列名也类似，不过一般选择 Motifs的结果 选择 Transcription Factors后，列表主要以TF呈现结果 B：两个Motifs 总共对应的 TF。其中Filter 绿色✔即为第一行Motifs对应的TF 画网络图时，如果对对应靶基因最多的TF感兴趣，直接选中，点击上方➕，就可出现对应网络 插件需要调整的参数较多，一般都是在原理涉及到的数据库，若想了解个中缘由可查看对应插件文献 默认参数，结果挑选对应靶基因最多的TF进一步研究 Curcumin suppresses LGR5(+) colorectal cancer stem cells by inducing autophagy and via repressing TFAP2A-mediated ECM pathway - PubMed (nih.gov)
大家可模仿一下这篇文献，先构建好miRNA网络，再根据文献对应参数，就可以出来和文章一样的网络图！
Identification of MicroRNA-Target Gene-Transcription Factor Regulatory Networks in Colorectal Adenoma Using Microarray Expression Data (nih.gov)
iRegulon webpage · Tutorial (aertslab.org)
iRegulon: From a Gene List to a Gene Regulatory Network Using Large Motif and Track Collections (plos.org)
Discovering protein-binding RNA motifs with a generative model of RNA sequences - ScienceDirect
The Human Transcription Factors - ScienceDirect
转录因子结合位点生物信息学研究进展 (chinagene.cn)
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