【原】【LorMe周刊】芽孢杆菌形成孢子的进化过程中发生的原噬菌体重组

LorMe青年 2021-07-28

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作者：吴锶杰，南京农业大学硕士在读，主要研究利用噬菌体防治青枯病。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊介绍孢子形成选择机制下细菌的生存与噬菌体进化之间的关系。原文于2020年发表在《The ISME Journal》上。

导读

噬菌体是细菌种内多样性的主要来源，也是水平基因转移的驱动力，但目前对这些移动基因元件(MGEs)如何驱动细菌遗传多样性尚不清楚。近期作者发现芽孢形成选择机制会促进枯草芽孢杆菌SPβ原噬菌体内的进化变化，从而导致种群内的直接拮抗作用。实验通过展示枯草芽孢杆菌的SPβ类噬菌体如何在芽孢形成过程中进行重组，为研究以噬菌体为进化驱动力的细菌进化提供了新的模型系统。

在芽孢形成选择机制下进化菌株携带杂交原噬菌体

作者发现枯草芽孢杆菌在休眠芽孢阶段的几代传代都会导致噬菌体颗粒自发释放到培养基中(图1A)。其中一些噬菌体类似于土著SPβ，会杀死原始菌株(图1B)。为了进一步表征释放噬菌体的进化菌株，对三个分离株进行了基因组测序。研究结果表明存在一个外源phi3T样噬菌体，它与SPβ密切相关(图1C)。作者将这个噬菌体命名为phi3Ts。Phi3T和phi3Ts之间的唯一区别是phi3Ts内有一725bp片段(标记为”s”，代表孢子形成)，取代了phi3T的1265bp片段(图1D)。尽管该”s”片段与phi3T或枯草芽孢杆菌168染色体没有同源性，但在来自世界不同地区的6株枯草芽孢杆菌的SPβ原噬菌体中均可发现该片段(图1D)。在进化菌株中，phi3Ts噬菌体要么破坏距SPβ~11 kb的kamA基因，要么与SPβ杂交，使kamA和SPβ之间缺失了~11 kb的片段(图1C)。

图1 在延长芽孢形成选择机制后观察枯草芽孢杆菌原噬菌体序列和整合位点的变化

杂交原噬菌体溶原菌株产生毒力杂交噬菌体

为了检测哪些噬菌体突变体释放到培养基中，将含有噬菌体的上清液滴在含Δ6菌株(缺失原噬菌体菌株的衍生物)的平板上，然后从单个噬菌斑中纯化噬菌体并测序。结果表明，自发产生的噬菌体是phi3Ts或phi3Ts-SPβ杂交体，从混浊噬菌斑获得的所有噬菌体也可以在进化菌株的基因组内鉴定出来(图1C和2A)。此外，Hyb1^phi3Ts-SP^β(由B310 mA释放)的基因组延伸了~1.2kb的宿主染色体片段(yozE、yokU和部分kamA基因)，这表明存在特异性转导，发生在噬菌体在其附着位点附近获取宿主染色体DNA片段时(图1C和2A)。从透明噬菌斑中获得的所有噬菌体均为phi3Ts-SPβ杂交体，且不存在于其相应生产者的染色体上(图1C和2A)，表明它们是毒力phi3Ts-SPβ变体。

作者还鉴定出从10.9到66kb的各种染色体外噬菌体DNA(epDNA)片段(图2B)。epDNA主要由phi3Ts-SPβ重组体控制，其中两个亲本噬菌体的DNA在同源区连接(图2B)。鉴定了16个独特的重组位点后(epDNA和杂交噬菌体结合)，其中15个位于phi3Ts-SPβ同源区域，主要集中在枯草芽孢杆菌染色体phi3Ts的左臂/SPβ的起始部分。作者又在SPβ的yosA基因和未知的phi3Ts基因之间的区域发现了一个非同源重组位点(图2B)。尽管没有一个杂交菌株的epDNA与相应菌株释放的杂交噬菌体序列完全相同，但Hyb2^phi3Ts-SP^β和Hyb3^phi3Ts-SPβ中的某些同源重组位点与epDNA中发现的同源重组位点重合(图2)。最后，作者还注意到一些epDNA片段包含靠近phi3Ts整合位点的部分细菌染色体，这是证明存在特异性转导的有利证据(图2B)。

图2 在进化菌株中检测到的杂交噬菌体和染色体外的噬菌体DNA片段

芽孢形成选择机制促进外源噬菌体侵染

接着在进化的宿主基因组中确定phi3TsDNA的来源。将来自枯草芽孢杆菌168祖先基因组的原始测序读数重复映射到选定的phi3Ts区域。phi3TsDNA在原始菌株中虽可检测到，但存在水平非常低(图3)。进化菌株B310mA和B410wtB的基因组测序确认phi3Ts整合到了kamA基因座上(图1C)。这些分析说明枯草芽孢杆菌168菌株从一开始就存在低拷贝数phi3Ts，表明激活原噬菌体不仅需要孢子形成选择机制，还需要低拷贝数phi3TsDNA或噬菌体颗粒。

图3 利用原始序列测序定位检测原始枯草芽孢杆菌168中的phi3Ts DNA

外源噬菌体对产孢动力学的调控

接着作者探讨了低拷贝phi3TsDNA的增殖及其整合到kamA基因中是否对枯草芽孢杆菌有正向适应性作用。由于kamA的表达在进入产孢阶段后显著增加，假设kamA编码的产物对细菌来说是代谢成本高昂和/或有毒的，因此由phi3Ts/phi3Ts-SPβ杂交原噬菌体溶原化的菌株可能受益于该基因的失活(图4A)。然而，野生型与ΔkamA菌株之间的竞争分析表明，在有和没有产孢选择的情况下，菌株之间的性能没有差异(图4B)。作者又研究了枯草芽孢杆菌3610经phi3T裂解后的产孢和孢子再生动力学。与野生型菌株相比，phi3T溶原菌提前产孢(图5)。总体趋势表明phi3T溶原恢复得更好，这可能包括更快的萌发和/或在休眠期间提前萌发的频率改变。结果表明，phi3Ts的传播可能部分是由与phi3Ts及其杂交种相关的调控库所带来的宿主利益驱动的。

图4 kamA在生长和产孢中的作用

图5 phi3T裂解对枯草芽孢杆菌芽孢形成和萌发动态的影响

结论

噬菌体在细菌生态和进化中的重要性是无可争议的。基因组比较表明，原噬菌体在其宿主内普遍被驯化，逐渐失去了通过裂解周期增殖的能力。本实验却出现了相反的情况，即在长期的芽孢形成和复苏选择机制后，枯草芽孢杆菌的原噬菌体SPβ通过与外源噬菌体DNA(phi3Ts)重组重新进入裂解周期。这种拮抗作用出现在噬菌体多样化的早期阶段，表明原噬菌体的形态可能是宿主细菌物种形成的第一步，揭示了细菌的生存策略与其噬菌体进化之间的显著关系。