【原】【LorMe周刊】亦正亦邪：真菌-细菌互作调节细菌生长

LorMe青年 2021-07-28

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作者：邵正英，南京农业大学博士在读。主要研究铁载体介导的根际细菌互作。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍通过对细菌突变体适应性进行基因组分析揭示真菌-细菌间互作对细菌的影响。原文于2021年发表在《Nature Microbiology》上。

摘要

真菌存在于不同的微生物群落中，但它们与细菌的相互作用仍然缺乏系统研究。为探究真菌-细菌互作对微生物群落多样性和功能的影响，本文通过RB-TnSeq技术，研究了8种不同真菌对2种细菌突变体适应性的影响。结果发现真菌存在时，细菌突变体适应性变化更大。此外，特定物种间的互作分析发现，真菌可能通过产生抗生素诱导细菌外膜压力的产生，导致细胞形态发生改变。本文证明真菌可通过全局调节子LaeA调节真菌特异性产物的产生，对群落内细菌生长产生影响。

真菌可能影响细菌的生存适应度

本文选取了八株真菌（两株酵母菌、六株丝状真菌)以及两株响应真菌的细菌P. psychrophila str. JB418（str.JB418）和E. coli K12（K12），探究真菌-细菌互作对细菌适应性的影响。通过随机条形码转座子测序技术（RB-TnSeq）建立突变体库，并为每个基因生成一个适应度值，反映一个基因在实验条件下对菌株生存的重要性。负值表明，基因的破坏会导致相对于野生型菌株生长的下降，而正值则表明生长得到促进。而单独培养与共培养条件下适应度差值称为“互作适应度”。当真菌存在增加了突变体适应度则会产生正的互作适应度，当突变体适应度降低了则产生负的互作适应度。

数据分析发现，真菌存在时，两种细菌基因适应度发生很大的变化，真菌对细菌生长有着较大的正面或负面影响（图1）。对所有真菌细菌互作条件下的基因交集进行分析发现，两株细菌分别与真菌Penicillium sp. str. 12（str. 12）以及Penicillium sp. str. SAM3（str. SAM3）一起生长时，会产生大量具有互作适应值的基因，且这两株真菌也与其他真菌分布较远（图2a,b）。

图1两种细菌较单独培养时，不同真菌互作下细菌基因适应度（a：添加大肠杆菌; b: 添加假单胞菌）

图2 在真菌存在下具有互作适应度的细菌基因的相互比较和功能表征

真菌可诱导细菌外膜的压力产生

继续对str.12和str.SAM3进行分析发现，两株真菌的存在皆会影响两株细菌有关药物外排泵和外膜压力应激相关基因突变株的适应性。进一步利用显微镜技术发现，str.12或str.SAM3会显著改变大肠杆菌K12细胞形态(图3a)，且与抗菌药物mecillinam、amoxicillin的作用相似（图3）。而ΔmdtK突变体（药物流出泵基因缺失）细胞形态则受到真菌更为强烈的影响。由于LaeA可控制真菌特异性产物的代谢，进一步构建str.12 ΔlaeA突变株与细菌共培养，结果显示细胞没有出现类似的形态变化（图3）。说明两株真菌可能通过产生抗菌物质对细菌产生外膜压力，而缺乏LaeA，则降低了某种抗生素的生产。

图3 大肠杆菌与青霉菌str.12以及str.SAM3或其LaeA缺陷株共培养条件下形态分析

真菌铁载体可促进细菌铁素营养吸收

由于运输铁载体enterobactin基因的缺乏，大肠杆菌K12突变体生长受损（图2c），但与任一真菌共培养后显著提高了Δfep突变体(ΔfepC, ΔfepG, ΔfepA和ΔfepB：负责细菌铁载体运输）的生长(图4a)。此外，大肠杆菌K12受真菌影响的348个上调基因中，有34个基因参与铁获取，其中就包括enterobactin合成、吸收的基因，说明，真菌存在时，细菌仍可吸收自身铁载体。细菌中负责吸收真菌型铁载体基因fhuA和fhuE也发生上调表达，证明细菌可通过调节fhu系统吸收真菌分泌的铁载体来缓解Δfep的生长缺陷。并且具有enterobactin吸收缺陷的ΔfhuA或ΔfhuE突变株（分别为吸收真菌铁载体ferrichrome、coprogen缺陷突变株）在分别添加coprogen、ferrichrome后消除生长缺陷（图4e）。后续实验证实靠近丝状真菌对铁载体相关基因缺陷细菌突变株生长具有恢复作用，且这种效果取决于fhuA或fhuE基因（图4f）。说明大肠杆菌会通过fhu系统利用真菌铁载体，丝状真菌可减少细菌对自身铁载体的依赖。

图4 细菌对真菌铁载体的利用情况

真菌对细菌的影响主要由真菌次级代谢物调节因子LaeA调节

特异性物质代谢在真菌对细菌的影响上发挥了重要的作用，而LaeA作为全局调节子对真菌细菌互作可能发挥决定性的作用。将str.12真菌ΔlaeA突变株与大肠杆菌共培养后发现，仅有少部分基因具有互作适应值（图5a）。此外，ΔlaeA不仅减少了铁载体的产生还消除了真菌str.12给细菌Δfep带来的正向互作效应（图5b）。这说明真菌对细菌的影响主要来自特异性代谢物质的产生。

对青霉菌str.12野生型与ΔlaeA基因组分析发现，ΔlaeA中11个基因簇显著下调，其中包含与铁载体合成与运输相关基因。进一步利用LC-MS对str.12野生型与ΔlaeA代谢物质的量进行比较，发现ΔlaeA突变体中代谢物质含量显著更少（5d)。证实了ΔlaeA突变株中特异性代谢物质的减少，以及LaeA对特异性物质代谢的调节作用。

图5 真菌代谢物的产生会影响细菌与真菌的相互作用

结论

真菌-细菌互作对微生物群落会产生巨大影响。本文发现，青霉菌和酵母菌存在时会给细菌突变体适应性带来很大影响。真菌互作会导致细菌对自身铁载体需求减少，但会促进对真菌铁载体的吸收。此外，本文还证明真菌LaeA（负责调节特异性产物）基因的缺失，可导致大量影响细菌生长的物质的减少。这说明，特异性产物在真菌和细菌互作种间发挥了重要的作用。真菌对细菌群落的组成与功能发挥重要作用，且与特异性物质的分泌有很大联系。在探究微生物群落功能时，真菌的作用不容忽视。