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双萤光素酶实验的具体步骤 1、报告基因质粒的构建。将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上，如pGL3-basic。 2、转染细胞。将报告基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，根据需要对细胞进行处理。共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为10:1~50:1。 Luciferase活性测定： ⑴ 初次使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。 ⑵ 加入1X PLB，室温裂解细胞15 min。 ⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能够终止LAR II的反应。 ⑷ 测定荧光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次读数，即为Renilla luciferase的值。 ⑸ 数据处理。首先计算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。 实验注意事项 1、为保证荧光素酶检测试剂的稳定性可以采取适当分装后避光保存的方法，以免反复冻融和长时间暴露于室温。 2、为取得最佳检测效果，同一批样品最好保证相同的测定时间，通常为10 s。 |
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