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1.RNA提取： 针对茎环状结构RT引物，RNA正常提取就好;对于Oligod(T)特异的RT引物，尽量用特殊试剂盒提取miRNA。 2.反转录： 反转录过程对酶没有特殊要求，操作按照反转录酶的说明书进行。对于引物，在反转录过程中只需加入Oligod(T)特异的RT引物或茎环状结构RT引物，不需要另外添加其他RT引物。用Oligod(T)特异的RT引物时，RNA需要进行3'Poly(A)加尾处理。 内参基因不需要单独设计RT引物，可以用荧光定量PCR的反向引物作为RT引物。 3.荧光定量PCR： 先优化PCR体系(引物浓度、退火温度等)，进行引物测试，确保扩增曲线正常且溶解曲线为单一的尖峰，阴性对照无扩增，则引物测试合格，再进行后续实验(常规操作)。 |
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