好不容易搞到的临床样本，RNA浓度太低怎么办？

又是周四啦，我们又见面啦。现在地标北京，我今天到北京来参加儿博会的交流学习。这是第一次觉得北京比重庆热，北京温度34℃，而重庆是27°。感觉还挺奇特的。今年重庆的天气简直好到爆，看了最近天气预报，一直到月底才会升温。在这里先感谢我的小仙女师妹，因为昨天晚上离开实验室比较急，很多素材还没有拍照。所以远程遥控了她帮我拍的照片。这有一半她的功劳。

在过去的一周比较特别，因为我做了有关qRTPCR的实验。为什么特别呢？第一，我的标本是一批子宫内膜原代上皮细胞；第二，这批细胞存放在RNA裂解液，并放置于-20℃冰箱中14个月（图1）；第三，因为细胞珍贵且存放时间长，所以提取出的RNA含量平均只有10-40ng/uL；第四，因为即将毕业，所以把实验安排的比较急，一天做了10个96孔（图2）。

这次的整个实验开始都是在一个十分不利的环境中，我和很多人一样都想过要放弃。但是，但是因为这个细胞十分珍贵，非常难培养，且来之不易（这是我的导师从美国给我带来的）。另外之前我也做过几十ng/uL的RNA标本，所以斗胆一试。

图1

图2

那面对这样浓度的RNA标本，我首先要把RNA浓度给提升上去，那怎么提升呢，今天给大家分享我常用的两个DNA/RNA浓缩方法。

真空浓缩

所谓浓缩，就是在总含量一定的基础上，减少液体体积量，这样浓度就会提升上去了。就是基于这么简单的一个道理，Thermo fisher生产了一台可以浓缩DNA/RNA的仪器，如下图3。

图3.png

这个东西非常简单易操作，我们之前一起做实验的战友曾经做了一系列实验来验证最好的真空温度、速度及时间，最后得出来：

一般RNA标本在选择中档，中温，一个小时内，RNA的浓度可以提升2-5倍，并且不会降解。如果时间过长、温度过高都会造成RNA的降解；对于DNA标本的话，可以自行选择。

需要注意

1. 在使用机器前最好把机器从内到外用75%酒精消毒，小心操作，尽量避免所有可以接触到DNA酶或RNA酶的操作。在这里，肯定有很多人会质疑说高温会不会使RNA/DNA降解，尤其是RNA。不知道大家在使用Takara进行RNA逆转的时候，第一步有个85℃的步骤，不知道有没有注意到呢。

2. 因为这个机器主要装1.5或2mL的EP管，所以在操作时需要把盖子打开，所以如果有可能请将此仪器放入一个相对比较干净的环境。

3. 其他的操作按着说明书来就可以。

第二种浓缩方法

另外一种浓缩方法是许多测序公司用来浓缩的办法，我也不晓得具体叫什么名字，所以直接介绍步骤。

准备工作

1. 配置3M pH=5.2的醋酸钠，0.22um滤器过滤保存，切记，此溶液若想长期保存，请置于玻璃容器中（一般人我不告诉他）不然容易析出，短期使用的话是可以放在塑料容器中的。

2. 配置75%的乙醇，此处用于配置的无水乙醇需要用到分析纯，至于-20°中保存。

3. 准备一定量的无水乙醇至于-20°中保存。

4. 准备异丙醇。

正式实验

1. 在RNA/DNA标本中加入1/10体积的醋酸钠，混匀。

2. 加入1中2倍体积的100%、-20°保存的无水乙醇，混匀，置于-80°中至少放置20min或-20°中至少放置2h。

3. 加入2/3体积的异丙醇，室温放置1min。

4. 离心，大于11000g，4°，30min。

5. 弃上清，加入75%冰乙醇混匀。

6. 重复步骤4。

7. 控干，加入需要体积的DEPC水。

因为我之前有多次用Thermofisher DNA L200浓缩RNA的经验，并且我只是希望RNA的浓度提升到60-70之间。所以我这一次实验就是用真空浓缩了RNA，中档、半小时，最后测定的浓度大概升高了2-5倍。

逆转录

我们都知道一个逆转录体系一般逆转1ugRNA，20uL体系。而你得到的cDNA在做qRT-PCR时会稀释10倍再用，每一个qRT-PCR反应用到2uL。意思就是你的RNA量有个5ng/uL就可以做出后面的qRT-PCR。看到这里，是不是很兴奋。我通过这样一算，瞬间觉得我肯定做的出来。

1. 我把RNA统一到30ng/uL。

2. Takara的体系最多可以加到7uL的量，意思就是我的每个逆转录反应体系用到的总RNA量是210ng。

3. 因为标本珍贵，所以也就没有在乎逆转录酶了，我的RNA总体积是30-40uL，所以我每个标本逆转了4-5个，所以总共是80-100uLcDNA。

4. 根据以上我们可以知道我的这个cDNA还可以对半稀释。

qRT-PCR

我最后用了上述的cDNA跑了10个板子的荧光定量PCR。给大家看看其中一组的扩增曲线。

qRT-PCR.png

最后结果还挺好的。之所以分享这次经历，并不是让大家铤而走险哟，只是告诉大家在标本很珍贵的情况下，多一种可能性，多一种选择。希望大家实验顺利。最后来张北京的天，证明我来了，哈哈哈哈哈哈。好无聊。

北京.png