BIOMED-2标准化免疫球蛋白基因重排技术在石蜡包埋弥漫大B细胞淋巴瘤组织中的应用孙 娟1，艾晓非1，李庆华1，曹 增2 （1.中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所 血液病医院病理中心，天津 300020；2. 天津医科大学附属肿瘤医院血液科 天津市肿瘤防治重点实验室，天津 300060） 摘要：目的 探讨石蜡包埋组织标本应用BIOMED-2标准化免疫球蛋白（IG）基因重排技术检测弥漫大B细胞淋巴瘤 （DLBCL）的可行性。 方法 从45例石蜡包埋组织标本中提取DNA，采用BIOMED-2系统引物进行多重聚合酶链反应（PCR）扩增，并应用PCR片段分析法进行IG基因重排的克隆性分析。结果 将DNA由原浓度100～500 ng/μL稀释至50～100 ng/μL后 ，DNA扩增最大片段（300～400 bp）含量由10.0%提高到90.0%；45例DLBCL石蜡切片标本提取DNA进行免疫球蛋白重链基因（IGH）和免疫球蛋白kappa基因（IGK）克隆性分析，IGH+IGK阳性率达到84.4%；15例反应性淋巴组织增生标本进行IG/T淋巴细胞抗原受体（TCR）克隆性分析，未见克隆性重排。 结论 稀释DNA是唯一可以既提高DNA扩增最大片段又能提高克隆性检出率的方法。在DLBCL的诊断和淋巴组织增生性疾病的鉴别诊断中，BIOMED-2标准化体系检测IGH基因克隆性重排是一种快速、可靠的方法，具有重要的临床应用价值。 关键词：基因重排；石蜡包埋组织；弥漫大B细胞淋巴瘤 弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是一种高度异质性的疾病，临床表现和预后差异较大。经典的预后评价系统国际预后指数评分是基于年龄、疾病分期和体能状态等简单的临床参数 ，由于其自身的局限性和利妥昔单抗纳入DLBCL的一线治疗，经典指标的预后价值存在争议 。随着对于DLBCL认识的深入和新技术的出现，越来越多新的DLBCL预后评价指标涌现。DLBCL的恶性程度高，如能早期诊断，就可以更好地为患者提供精确的诊断分层和个体化治疗，其意义重大。 病理科保存的甲醛固定石蜡包埋组织是分子生物学研究材料的可靠来源。目前，国内外已有不少文献报道从石蜡包埋组织中成功提取DNA分子进行分子病理学研究［1］。然而，石蜡包埋组织在制作过程中受到多种理化因素影响，造成DNA降解严重，使得聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增结果不稳定，如何保证DNA分子的相对完整和纯度是必须解决的难题。本研究通过BIOMED-2标准化免疫球蛋白（immunoglobulin，IG）验证石蜡包埋组织提取DNA检测淋巴瘤的可行性，消除干扰物质，寻找适合PCR扩增的DNA最佳浓度。另外探讨了石蜡提取DNA的扩增最大片段与IG基因重排不同引物区域阳性检出率之间的关系。 材料和方法一、临床标本 收集2014年5月到2015年12月中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院病理中心及外院送检的确诊为DLBCL的石蜡包埋组织标本共45份。所有病例的诊断均按照2008年世界卫生组织淋巴瘤分类标准进行分型［2］。其中男23例、女22例，年龄37～74岁（平均50.4岁）。标本均为手术切除组织。另选取诊断为淋巴结反应性增生病变的活检组织15份作为对照。所有石蜡切片均进行70 ℃烘烤40 min脱蜡。所有入选患者均签署知情同意书，并经医院伦理委员会审批同意。 二、方法 1.石蜡包埋组织DNA的提取 将石蜡切片（5～10 μm厚，5～8张）装入1.5 mL无菌离心管中，加入1 mL二甲苯脱蜡后，再加入1 mL无水乙醇去二甲苯。采用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取DNA，操作按试剂盒说明书进行。 2.DNA质量鉴定 提取的DNA浓度与纯度采用Nano Drop 2000超微量分光光度仪（Thermo Scientific公司）检测，吸光度（A）260/280nm值≥1.8～2.0。使用基因重排试剂盒自带Specimen Control Size Ladder mater mix试剂（美国Invivoscribe公司）检测DNA产物最大片段。 3.PCR扩增 应用免疫球蛋白重链基因（IGH）和免疫球蛋白kappa基因（IGK）重排试剂盒（美国Invivoscribe公司）对反应性淋巴组织增生和DLBCL石蜡包埋组织DNA的IGH/IGK重排进行多重PCR检测。PCR反应条件：95 ℃ 预变性 7 min；95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR引物由该试剂盒提供。 IG基因重排产物的克隆特性分析结果判断：取1 μL PCR产物与10 μL甲酰胺及0.1 μL Genescan-500荧光标记相对分子质量标准品（美国ABI公司）混合，经95 ℃ 2 min热变性，4 ℃ 5 min后采用3730型基因分析仪（美国ABI公司）进行PCR产物片段分析，结果使用 Gene mapper v4.0软件（美国ABI公司）分析。结果参照参考文献［3］进行判断。 三、统计学方法 用SPSS 17.0 软件对数据进行统计。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结 果一、DNA产物最大片段 本研究选取30例患者的石蜡包埋组织，通过Specimen Control Size Ladder mater mix试剂检测DNA产物最大片段，保证实验过程中无抑制PCR的因素存在，并保证标本DNA是足量且完好的，DNA标本扩增产物应至少300 bp，见图1。 提取后DNA浓度为100～500 ng/μL不等，其PCR产物最大片段分布在100、200、300 bp，通过稀释调整DNA浓度至50～100 ng/μL后，标本PCR产物的最大片段有了较大提高，见表1。DNA浓度A260/280nm值大都在1.8～2.0范围内，提示可作为重排检测的有效模板，其余产物＜100 bp，视为DNA降解 。  图1 PCR片段分析检测提取DNA的完整性（3730基因分析仪检测截图） 注：1～5分别为PCR扩增条带 30例DLBCL患者IGH/IGK基因重排PCR产物质量分析显示，石蜡包埋组织提取的DNA浓度为100～500 ng/μL，其PCR产物最大片段分布在100、200和300 bp，以100或200 bp为主。通过稀释调整DNA浓度至50～100 ng/μL后，标本的PCR产物中300～400 bp 片段占90.0%（表1）。当DNA浓度为50～100 ng/μL时，石蜡切片标本DNA产物最大片段均在300 bp以上，达到了确保基因重排检测准确性的标准。 表1 PCR产物最大片段与DNA浓度比较 ［例（%）］  注：与DNA最佳稀释浓度（50～100 ng/μL）300 bp组比较，*P＜0.01 100～300 ng/μL 300～500 ng/μL 1006（20.0）10（33.3）0（0.0）2007（23.3）4（13.3）3（10.0）3002（6.7）*1（3.3）*26（86.7）*4000（0.0）0（0.0）1（3.3）PCR产物最大片段（bp）DNA标本原浓度（30例）原浓度DNA标本稀释到50～100 ng/μL（30例） 二、DLBCL患者IGH/IGK克隆性重排分析 应用IGH V-J区域和IGK 2组引物进行克隆性分析，45例DLBCL患者中有34例检测出单克隆IGH重排，敏感性为75.56%（34/45），包括FR1、FR2和FR3框架区任一引物扩增产物克隆性重排或者 2～3个引物扩增产物均发生克隆性重排；有29例检测出单克隆IGK重排，敏感性为62%（29/45）。联合应用扩增IGH V-J和IGK的引物时，克隆性重排的检出率达到了84.4%（38/45）。 15例反应性淋巴组织增生石蜡切片提取DNA终浓度调整在50～100 ng/μL，其PCR产物最大片段均在300 bp以上，其IG/T淋巴细胞抗原受体（T-cell receptor，TCR）基因未见克隆性重排。 讨 论普通甲醛固定石蜡包埋组织中DNA提取质量较差的原因有2个：一是DNA经过各种理化因素刺激及残留DNA酶的作用后产生降解［4］，二是经过化学药物作用后，组织细胞内的DNA变得更脆弱，致使其在提取过程中对理化环境的变化更加敏感，更易断裂。在DNA提取过程中，虽然不能避免DNA降解对DNA标本质量的影响，但可以尽量减少引起DNA断裂或抑制PCR的干扰物质。 从30例DLBCL患者提取DNA的比较看，二甲苯虽然脱蜡较为彻底，但反复脱蜡容易导致DNA链降解。石蜡切片先进行70 ℃的烘烤，有效地减少了标本的蜡量，有利于降低PCR中的抑制物质。在原浓度下DNA扩增最大产物大部分为200 bp或更小，而稀释到50～100 ng/μL的最佳DNA浓度时，PCR扩增效率明显提高，大部分DNA标本PCR扩增产物至300 bp。由此可见，DNA标本的浓度对PCR产物的片段大小有明显影响，DNA浓度超过300 ng/μL时会抑制大的扩增产物（300 bp或以上）。同时，稀释DNA标本可以提高克隆重排的检出率，IGH+IGK阳性率从原浓度的46.7%提高到83.3%。此现象的解释可能为DNA浓度在稀释的同时也使影响PCR扩增的抑制物质被稀释。如果影响PCR扩增抑制物质存在且DNA标本没有降解，那么稀释DNA标本是唯一既可提高PCR扩增最大片段又能提高克隆性检出率的方法［5］。 目前，对IG/TCR基因重排进行克隆性分析的方法有2种：（1）异源双链分析。首先对PCR产物进行加热变性，再置冰上使之形成异源双链，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳后产生条带的多寡来判断IG/TCR基因重排的克隆特性。其优点是检测成本较低，电泳条带可用于回收、纯化，便于后续单或寡克隆 IG/ TCR基因重排的准确测序，但操作耗时、繁琐，敏感性低，分析难度大。（2）基因扫描。在PCR产物中加入荧光素标记的下游引物，进行不对称扩增以得到带荧光素标记的单链DNA，经热变性和降温后，置于DNA序列分析仪中检测， 由基因扫描软件根据荧光素标记所显示的产物位置（反映产物大小）、高度（反映产物含量）和形态（反映产物均一性） 进行克隆性分析。其优点是简便、快捷、高通量、自动化程度高、敏感性高，且扫描结果可精确到具体的碱基数量，缺点是需要专门的检测设备［6］。 DLBCL是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL）中发病率最高的亚型，占所有成人NHL发病率的30%～50%，中位发病年龄为＞60岁。DLBCL由于其自身高度异质性所致临床表现、治疗反应和预后差异较大。近年来，随着新型分子标志物不断被发现，DLBCL的诊断和预后体系不断完善。因此，运用分子病理学方法检测IGH基因的克隆性对辅助诊断非常有意义。45例DLBCL石蜡包埋组织切片标本IGH+IGK克隆性检出率为84.4%，反应性淋巴细胞增多未见克隆性重排。IGH不同区域引物所扩增的片段长短不一（FR1、FR2和FR3引物预期片段长度分别为310～360、250～295和100～170 bp），长片段的扩增效率低于短片段。在大多数IG/TCR的对照试验中，300 bp的目的片段被很好地扩增就能验证实验结果的可靠性［7］。然而，即使只获得了200 bp的对照扩增子或者更小的IG/TCR扩增子，其扩增的克隆重排仍可以看作是可靠的实验结果。 IG基因重排检测技术是检测淋巴细胞克隆性增生的快速、灵敏方法［8］，可用于恶性淋巴瘤的早期诊断和鉴别诊断，特别适用于在DNA未被降解的石蜡包埋组织标本中提取的DNA质量符合要求（DNA浓度50～100 ng/μL，纯度A260/280nm值1.8～2.0，PCR最大扩增片段在300 bp以上）时的检测。因此，BIOMED-2多重PCR检测IG/TCR基因重排应用于石蜡包埋组织标本是可行的，尤其在常规HE（hematoxylin-eosin staining）、免疫组织化学检测仍无法区分淋巴细胞恶性或反应性增生的情况下，IG/TCR基因重排的克隆性检出将对诊断有重要的指导意义。 参考文献 ［1］GILLIO-TOS A，DE MARCO L，FIANO V，et al. 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Abstract：Objective To investigate the feasibility of detecting diffuse large B cell lymphoma（DLBCL）with the application of BIOMED-2 standardized immunoglobulin（IG） gene rearrangement detection in paraffinembedded tissues. Methods DNA was extracted from 45 paraffin-embedded tissues. Multiple polymerase chain reaction（PCR） amplification was performed，and clonality analysis for IG gene rearrangement was performed by BIOMED-2 system primer. Results When DNA concentration was diluted to 50-100 ng/μL from 100-500 ng/μL，the proportion of the longest amplification fragment（300-400 bp） of DNA was improved from 10.0% to 90.0%. In 45 cases of DLBCL，the positive rate of immunoglobulin heavy chain（IGH）+ immunoglobulin kappa chain（IGK）was 84.4%. For IG/T-cell receptor（TCR） clonality analysis，no clonal rearrangement was found in 15 cases of reactive lymphoid tissue hyperplasia. Conclusions Dilution of DNA is a method to improve not only the proportion of the longest amplification fragment but also the detection rate of clonality. BIOMED-2 standardized immunoglobulin gene rearrangement detection is an efficient and reliable method for the diagnosis of DLBCL，with important clinical significance. Key words：Gene rearrangement；Paraffin-embedded tissues；Diffuse large B cell lymphoma 文章编号：1673-8640（2016）09-0810-04 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2016.09.017 （收稿日期：2015-08-07） （本文编辑：范基农） 作者简介：孙 娟， 女， 1978年生， 学士， 主管技师，主要从事血液病理实验工作。 通讯作者：曹 增，联系电话：022-23340123。 |
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