背景：中药配方神香苏合丸在临床上广泛用于治疗冠心病。但由于神香苏合丸成分复杂，其基本机制和药理动力学性质仍然未知。本文试图通过双重筛选具抗炎和抗氧化效果的活跃成分定义神香苏合丸的化合物，并用网络药理学预测其在冠心病治疗中的多靶向通路。
方法：神香苏合丸的化学成分用UPLC/Q-TOF进行分析。然后用体外实验双重筛选具抗炎和抗氧化效果的活跃成分。用IPA分析和预测神香苏合丸抗炎和抗氧化效果的潜在靶向和通路。
结果：神香苏合丸可识别化学成分有38种，筛选出六种抗炎化合物：木犀草素、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、4-羟基-3-甲氧基肉桂醛、苯甲酸、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷酸、艾纳香素；五种抗氧化化合物：香草醛、丁香酚、麝香酮、木犀草素、积雪草酸。IPA表明，丁香酚,、麝香酮和4-羟基-3-甲氧基肉桂醛与HIF-1和IL-15通路密切相关。HIF-1和IL-15分别起到保护氧化应激和发炎的效果。
结论：在神香苏合丸的38种成分中，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷, 艾纳香素和 4羟基-3-甲氧基肉桂醛的抗炎药理学作用为首次记录。据网络药理学分析，丁香酚, 4-羟基-3-甲氧基肉桂醛和麝香酮与抗氧化的HIF-1通路和抗炎的IL-15通路有关，这可能是神香苏合丸治疗冠心病的机制。
原名：Dual-screening of anti-inflammatory and antioxidant active ingredients of shenxiang suhe pill and its potential multi-target therapy for coronary heart disease
译名：神香苏合丸抗炎和抗氧化活跃成分的双重筛选及其潜在冠心病多靶点治疗
期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy
影响因子：4.545
发表时间：2020.06.19
通讯作者：张招建、王小莹
通讯作者单位：天津中医药大学现代中药国家重点实验室
DOI：10.1016/j.biopha.2020.110283
Biomedicine & Pharmacotherapy
Biomedicine & Pharmacotherapy是一家法国医学杂志，成立于1956年，每年发行10期，主要发表癌症、神经、心血管和传染性疾病领域的文章，2020年科睿唯安影响因子为4.545。本文将刊发于Biomedicine & Pharmacotherapy第129卷（2020年9月发行）。
神香苏合丸源自南宋“国家药典”——《太平惠民和剂局方》所收载的“苏合香丸”，由明清大医家张路玉在局方基础上加以改良，命名为“神香苏合丸”，收载于《张氏医通》。1874年，胡雪岩创办胡庆余堂，即收录于胡庆余堂堂簿之中。
时至今日，神香苏合丸是杭州胡庆余堂药业有限公司的独家品种，一度改名为“庆余救心丸”，有通温宣痹、行气化浊的功效，用于冠心病的治疗，是一种开窍醒神的温通良药。
神香苏合丸的处方包括人工麝香、冰片、水牛角浓缩粉、乳香（制）、安息香、白术、香附、木香、沉香、丁香和苏合香等11味药，其中九味都是芳香性药材，具有强烈的芳香开窍作用；同时，为了抑制芳香性药材的热性，配方中又加入了健脾益气的白术和清心解毒的水牛角浓缩粉。
神香苏合丸通过汇集众多芳香药材中的酮类、酯类、萜类化合物的天然活性成分，而起到抗血小板聚集、抗凝血、增加冠脉血流量、促进冠脉及心内膜血栓溶解，进而改善心肌缺血，纠正心肌代谢紊乱的功能。
杭州胡庆余堂药业有限公司通过工艺创新，将神香苏合丸由原先的大丸改进为微丸，大大增加了服用便利性，也缩短了起效时间。
采用超高效液相色谱/四极飞行时间（UPLC/Q- TOF）系统分析神香苏合丸的主要成分，用体外双重筛选分析抗炎和抗氧化活性成分。采用网络药理学，以神香苏合丸的成分为核心研究对象，预测相应的靶向和路径，探索神香苏合丸在预防和治疗冠心病方面的潜在机制，为临床应用提供理论基础。
2. 细胞培养
在含0.1 mg/ml链霉素和10 U/mL青霉素的高浓度葡萄糖DMEM中培养人胚肾细胞。在含10% FBS、0.1 mg/ml链霉素和10 U/mL青霉素的高浓度葡萄糖DMEM中培养人脐静脉内皮细胞系EA.hy926。所有细胞在使用前都需要在96孔培养皿中进行12小时的融合。
3. 抗炎成分筛选
在细胞融合度为50-70%时进行转染。NF-κB荧光素酶指标物为基因质粒pGL 4.32（100 ng/孔），转染24小时后再进行处理，再进行双荧光素酶化验。
用含TNF-α（10 μL/mL）的DMEM培养Hek 293细胞6小时。细胞用地塞米松（DEX，1 μmol/L）和UPLC残留物（用DMEM稀释，浓度等于神香苏合丸有效浓度）预处理2小时再进行转染。用双荧光素酶指标物试剂盒（Promega, USA）探测NF-κB的转录活动。
4. 抗氧化成分筛选
培养后的EA.hy926细胞用PBS清洗两次，再加入PBS（100 μL/孔）。培养皿置于封闭低压氧仓6小时，低压氧舱置于37℃的恒温箱中。6小时后，用尼莫地平（1 μmol/L）和UPLC残留物（DMEM稀释，浓度等于神香苏合丸的有效浓度）替换PBS，培养16小时，分别进行细胞活性（用MTT化验测量）和LDH释放化验。
5. 抗炎和抗氧化活性成分的靶向预测
筛选后的抗炎和抗氧化活性成分输入疗效组Pharm-Mapper靶向数据库公网服务器获得对应的靶向。将得到的TOP 200靶向输入UniProt数据库转换为基因格式。然后将基因输入IPA获得对应的通路。根据筛选通路及相应靶向和成分建立神香苏合丸的成分-靶向-通路说明。
1. 识别神香苏合丸活性成分
采用UPLC/Q- TOF系统分析神香苏合丸的主要成分，在根据Lipinski原理识别可吸收成分，共识别出神香苏合丸的38种成分和18种可吸收成分。
2. 筛选神香苏合丸抗炎成分
六种成分可以抑制NF-κB的表达，具有抗炎效果：木犀草素、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、4-羟基-3-甲级肉桂醛、苯甲酸、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷酸和艾纳香素。
图1. 筛选神香苏合丸的抗炎成分. （A）神香苏合丸抗炎活性的有效浓度范围.（B）基于UPLC的活性时间段. (C)抑制NF-κB表达的神香苏合丸活性成分. (D)活性成分的结构. 值表示为均值±SEM，每组n=6. ##P < 0.01（比较对照组）. *P < 0.05, **P < 0.01（比较模型组）.
3. 筛选神香苏合丸抗氧化成分
五种成分可以抑制LDH的释放，进而抑制细胞毒性，具有抗氧化效果：香草醛、丁香酚、麝香酮、木犀草素和积雪草酸。
图2. 筛选被MTT和LDH释放法探测到的神香苏合丸抗氧化成分. (A) 促进细胞增殖的神香苏合丸有效浓度. (B) 基于通过MTT化验的UPLC的活性时段. (C) 神香苏合丸促进细胞活性的活性成分. (D)神香苏合丸抑制LDH释放的有效浓度. (E) 基于通过LDH化验的UPLC的活性时段. (F) 神香苏合丸抑制细胞损伤的活性成分. (G) 活性成分的结构. The 值表示为均值± SEM, 每组n = 6. ###P < 0.001, ##P < 0.01（比较对照组）; ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05（比较模型组）.
4. 潜在靶向和通路
将抗炎和抗氧化效果筛选所得的10种活性成分输入Pharm-Mapper，共得到295个靶向。将这些靶向输入IPA，产生了519个受这10个神香苏合丸活性成分（图3A）调节的通路。从中选择TOP 23通路（图3B）。TOP 23通路与142个靶向有关，其中MAPK1、MAPK8、AKT1、MAPK14、MAPK10、HARS和RAC1与大部分通路有关，表明它们是主要靶向。在TOP 23通路中有一些发炎和氧化相关通路受这些活性成分调节，包括HIF-1信号（TOP 10）、以LPS/IL-1为媒介的RXR功能抑制（TOP 2）、STAT3通路（TOP 17）、IL-15产生（TOP 5）、FXR/RXR激活（TOP 15）、白细胞溢出信号（TOP 16）、LXR/RXR激活（TOP 23）和以NRF2为媒介的氧化应激反应（TOP 14），以及巨噬细胞中一氧化氮和活性氧的产生（TOP 22）。这些结果与体外实验数据一致。
在受活性成分调节的靶向中，我们识别出16个带炎性损伤、氧化应激和冠心病关键词的相关靶向，表明这些靶向是神香苏合丸通过抗炎和抗氧化活动治疗冠心病的核心靶向（图3C）。在其潜在靶向中，前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）是重要的炎性疾病靶向，并且细胞内PTSG2的上调常常与抗细胞凋亡、细胞粘着和肿瘤血管再生有关。B细胞淋巴瘤-2（BCL2）常常会参与发炎反应、氧化应激反应和冠状动脉疾病，它是细胞凋亡通路的重要成分。
图3. 化合物、靶向、通路和疾病说明. (A)受神香苏合丸活性成分调节的“化合物-靶向-通路”网络. (B) 符合P-value > 10标准的Top 23经典通路. (C) 基于炎性反应和氧化应激反应的靶向和冠心病关系的网络地图
此外，细胞对低氧的反应取决于转录因子族中的低氧诱发因子（HIF）的活性，HIF-1负责急性反应，与细胞代谢和细胞死亡有关。如图4A所示，AKT1、HRAS、HSP90AA1、MAPK1、MDM2和 MMP8靶向能调节HIF-1的激活，主要是通过产生红细胞和血管再生（VEGFA）和血管张力（HMOX1、NOS2、NOS3）以及通过促进无氧代谢和调节细胞增殖和凋亡从而降低耗氧量以实现保护心肌细胞的效果。上述所有结果都表明神香苏合丸能调节PTGS2、BCL2、NOS2和其他靶向，从而实现抗炎和抗氧化效果，起到治疗冠心病的效果。
另外，我们根据P值筛选了所有与活性成分调节和冠心病有关的通路，发现HIF-1和IL-15分别为抗氧化和抗炎效果最佳。这样，我们就得到了化合物-靶向-通路图解，如图4B和图4C所示，丁香酚、麝香酮和 4-羟基-3甲氧基肉桂醛占通路的最大比例，表明这三种化合物对神香苏合丸的抗炎和抗氧化活性贡献巨大。
图5. 基于HIF-1信号通路（A）的神香苏合丸活性成分网络，以及神香苏合丸活性化合物以及它们在HIF-1信号通路（B）和IL-15信号通路（C）中的靶向的分析. 回路的规模代表通路重要程度.
炎性反应是导致冠心病的关键因素之一，它可以引起内皮损伤，令生物抗凝血剂不足，削弱血管舒张功能。此外，氧化应激也是冠心病的重要因素，它可以导致细胞功能失调，引起不可逆的细胞损伤和死亡。由于神香苏合丸成分复杂，很难厘清药用成分和活性机制。网络药理学被认为是研究和分析多成分、靶向和通路的好平台。本文试图结合双重筛选和网络药理学以迅速获得生物活性成分，并分析潜在多靶向治疗，从而为神香苏合丸治疗冠心病提供重要的临床应用指南。
经双重筛选，我们得到了六种抗炎活性成分，包括木犀草素、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、苯甲酸、4-羟基-3-甲氧基肉桂醛, 山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷酸和艾纳香素。有记录显示木犀草素可抑制巨噬细胞所产生的炎性细胞因子的表达，如TNF-α和 IL-6，这与抑制AKT磷酸化和抑制内皮细胞凋亡有关。我们发现它可以影响AKT1和BCL2，参与PI3K/AKT信号通路，并降低炎症和氧化损伤。苯甲酸和山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷酸能够减少与活性部位NF-κB的特异性结合，从而大大降低炎性介质和致炎性因子的释放。我们猜测它可能参与了NF-κB信号通路的相关靶向的调节，如KDR, LCK, MAPK8等。但是，几乎没有记录表明异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、艾纳香素和4-羟基-3-甲氧基肉桂醛有抗炎效果。本研究首次记录了0.1 μmol/L的 异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、0.1 μmol/L的 4-羟基-3-甲氧基肉桂醛、0.01 μmol/L 和 0.1 μmol/L 的艾纳香素可以显著降低NF-κB的表达。据IPA结果，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷可能通过调节MAPK族和HSP90AA1的表达并参与IL-8、IL-17 和IL-22细胞通路起到了抗炎作用。4-羟基-3-甲氧基肉桂醛的抗炎作用可能与MMP8、MDM2、NOS3 和PGF，以及与干扰PI3K/AKT信号通路有关，而艾纳香素的抗炎作用可能来自影响HIF-1α信号通路。
除此之外，我们得到五种抗氧化活性成分，包括麝香酮、积雪草酸、香草醛、丁香酚 和 木犀草素。此前的研究表明，麝香酮和积雪草酸可以缓解氧过多环境下的NO系统功能失调，激活内生抗氧化酶活性，后者与NO信号通路调节的一氧化氮合成酶的过度表达有关。据网络药理学，我们可以调节NOS2和MAPK族，参与关键性的氧和活性氧生成信号通路，从而抵御氧化应激。有记录表明香草醛和丁香酚可抑制ROS的产生，提升SOD和GSH水平，增强抗氧化反应元素的活性。这个过程与阻断Nrf2调节的氧化应激密切相关[26-30]。我们的结果表明，它可能通过调节GSK3β、NQO1/2 和MAPK族影响Nrf2调节的氧化应激反应信号通路，从而避免氧化损伤。此外，木犀草素可以抵抗过氧化环境引起的血管内皮损伤，并且与抗氧化，促进NO释放以及遏制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。这些结果可以为后续研究提供实验和合理基础。
基于网络药理学，本研究分析了十种活性成分的潜在靶向和通路，并预测了它们的药理学机制。结果表明，我们共获得295个潜在靶向，涉及到519个通路。在与心血管疾病关系最密切的10个通路中，包括芳香烃受体信号（TOP 1）、IL-15生成（TOP 5）、RAR激活（TOP 9）和HIF-1信号（TOP 10）。在芳香烃受体信号通路中，一种内生AHR信号可抑制VEGF的表达，降低心肌肥大从而影响心血管生理过程，并且在血压和一氧化氮生成中起到关键作用。IL-15可导致T细胞附着、激活、细胞因子分泌和血管生成，所有这些都在心血管疾病中扮演重要角色。RAR涉及调节细胞增殖、凋亡以及与AKT激活的分化，并能通过PI3K/ AKT信号通路抑制炎性介质的生成[33-35]。此外，HIF-1参与体内氧气的输送，这对于细胞存活和改善无氧代谢心血管疾病极其重要。此外，有11个靶向存在于所有通路中。其中，HSP90AA1、MAPK族, AKT和SRC与心血管系统密切相关。因此，可以预测，神香苏合丸治疗冠心病的主要作用与抗炎和抗氧化活性有关。通路间的互动实现了神香苏合丸的多通路和多靶向的总调节作用，因此在冠心病治疗中起到药理作用。
此外，网络药理学结果表明，丁香酚、麝香酮和4-羟基-3-甲氧基肉桂醛的效果值在十种活性成分中较高。通过深度分析，以疾病-通路-靶向的匹配度为标准，我们发现丁香酚、麝香酮和4-羟基-3-甲氧基肉桂醛可能主要是调节HIF-1和IL-15信号通路（分别针对氧化应激和炎性反应），对冠心病起到治疗作用。一方面，作为广泛存在于低氧环境体内的转录因子，有记录表明HIF-1参与体内的氧气输送，并且通过保持细胞生存、改善无氧代谢而在心血管疾病中扮演重要角色。冠心病导致相应区域的局部缺血和缺氧，从而提高HIF-1活性，然后激活与血管生成前因子有关的基因的转录，如VEGF和CXCL12，从而促进侧枝循环的形成，改善血流，缓解冠心病病程。估计丁香酚, 麝香酮 和4-羟基-3-甲氧基肉桂醛可上调MAPK8、MAPK14和MMP9，促进HIF-1信号通路，并一同缓解氧化应激。MAPK参与细胞的生长和分化。MAPK进入细胞核后可促进HIF-1的磷酸化，提升其表达，并引发下游基因VEGF的转录表达，从而有助于血管再生；与此同时，作为HIF-1的下游靶向基因，在低氧环境中产生的MMP9可诱使MMP9表达增加，而这与细胞外基质降解和血管生成密切相关。另一方面，研究表明IL-15位于致炎性细胞因子链的开端，其高表达可促使分泌TNF-α、IL-1和IL-6，抑制分泌IL-10，通过激活NF-κB聚集白细胞强化炎性反应。此外，内生IL-15在血管平滑肌和内皮细胞中有表达，并且可以通过循环系统进入血液，参与冠心病的发生和发展。丁香酚、麝香酮和4-羟基-3-甲氧基肉桂醛可能可以调节IL-15 信号通路中的SRC、FGFR1和LCK。抑制SRC和LCK可以在一定程度上阻断IL-15信号传递，缓解炎性反应。与此同时，在冠心病病程中，巨噬细胞不断分泌炎性因子，包括TNF-α 和IL-15，抑制FGFR1活性并减少的巨噬细胞浸润和炎性因子的分泌。因此，可认为丁香酚、麝香酮 和4-羟基-3-甲氧基肉桂醛是分别通过HIF-1和IL-15信号通路实现抗氧化和抗炎活性的核心成分。
神香苏合丸通过双重抗炎和抗氧化功能对冠心病具有治疗作用。在本研究中，我们用双重筛选得到了10种生物活性成分，其中，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、艾纳香素 和 4-羟基-3-甲氧基肉桂醛的抗炎药理学效果为首次记录。从网络药理学分析中，神香苏合丸的活性成分在多路径和多靶向中互相补充，其中，丁香酚、麝香酮和4-羟基-3-甲氧基肉桂醛主要涉及到与HIF-1和IL-15有关的经典通路，与MAPK8、MAPK14和MMP9一同发挥抗氧化作用，与SRC、FGFR1一同发挥抗炎作用。这可能是冠心病的治疗机制。
