二代测序 之 杂交捕获

写在前面：

本次更新主要介绍文库构建完成后对目标文库的富集方法——“杂交捕获法”，这一期小编将重点介绍杂交捕获法的实验流程及其作用。

1.为什么进行杂交捕获？

在文库构建完成后，若是做全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS），可直接将构建好的文库按照一定的浓度、测序深度、数据量进行上机测序即可。但在实际的操作中，由于人的基因组中存在大量丰富的重复DNA序列，且考虑到测序成本的问题，所以通常会进行靶向测序，即选择我们需要的区域进行测序，比如全外显子测序（Whole-exome sequencing，WES），或者针对肿瘤患者设计的特定的Panel测序等（一个Panel指包含所有探针的一个集合，eg：一个Panel里包含200个探针，200个探针的集合就是一个Panel）。那么如何获得所需的目标区域或者靶序列呢？就需要探针与靶序列进行杂交，然后再通过捕获杂交片段的方法进行目标区域的富集。

2. 实验流程&作用

2.1  杂交准备

杂交需要投入的原料：

①一定量的文库：可以是一个文库或者多个文库，多个文库的话可根据不同的接头序列区分每个样本；

②Human Cot DNA：封闭大量重复的DNA序列，避免非特异性杂交；

③Universal Blockers：封闭接头序列，避免非特异性杂交；

④不同的Panel：生物素标记的探针，主要负责与靶序列杂交；

⑤杂交Buffer、杂交Enhancer、NF水等（图中未展示）；

注：杂交原料进行杂交时，由于杂交体积限制，都会进行体积浓缩，常用到的是采用真空浓缩的方法；此外还有磁珠法浓缩；针对不同的浓缩方法，各种杂交原料的加入顺序有一定的差异。

真空浓缩法：①+②+③→真空浓缩→+④+⑤→杂交。

磁珠浓缩法：①+②+④→磁珠浓缩→+③+⑤→杂交。

真空浓缩法在小Panel杂交的过程中表现比磁珠浓缩法较好，但磁珠浓缩法更简便快捷，成本更低。

2.2 杂交

95℃将文库变性为单链状态；

65℃进行杂交；

注：A&C：表示探针与靶序列杂交；B&D表示未杂交。

2.3 捕获

通过链霉亲和素磁珠与生物素标记的探针特异性结合，再利用磁珠和磁铁之间的相互作用“抓”出靶标片段。

2.4 洗脱

该步骤主要是洗掉一些非特异性杂交的片段（65℃热热洗脱），以及未杂交的片段、多余探针、杂交Buffer、杂交Enhancer 等杂质，只保留与探针杂交的靶序列。

2.5 PCR扩增&纯化

通过PCR扩增对靶片段进行富集，PCR循环数根据Panel的大小而定（一般Panel较大扩增循环数较少，相反则较多）。

2.6 文库质检

①文库浓度：常用的是Qubit法对杂交文库浓度进行测定。

②文库质量：常用的是Agilent 2100测定杂交文库的片段大小范围。

文库质检与上机测序密切相关。

待续

小编后续会介绍杂交捕获过程中非特异性杂交的情况，同时会继续从每个步骤详细介绍NGS的流程。

今天来个小插曲→ 实验室的故事1

下面是一段来自实验室的对话：

A：一边做着实验一边对B说，我等会儿要做到恒温孵育了，帮我开一下孵育箱；

B：好的；

过了一会儿

A：走到孵育箱前一直笑，发现孵育箱的“门”确实是B帮忙打开了。