手拉手系列│PCR新手上路，从会看试剂盒说明书开始！

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最近，一些初入PCR实验室的萌新们，常常会困惑这样一个问题：“同为新冠病毒核酸检测试剂盒，最低检出限一致的情况下，结果判读的标准中Ct值相差较大，是为哪般？”

这是因为，萌新们还尚未练就这门基本功——学会看试剂盒说明书。

作为PCR老手，潜心钻研本门功课，将多年经验传授出来，让你一次学会看懂说明书，从而可以游刃有余地开展本科检测项目。

来吧，手把手带着大家，打开试剂盒说明书，一起开始练功。

第一步，通过【检验原理】确认：

 ◆  检验方法学

 ◆  检测靶基因

 ◆  靶基因对应的标记荧光

 ◆  内标基因的选择及来源

例如，图片展示：我们可以了解到这款试剂盒

 ◆  通过实时荧光PCR技术检测

 ◆  检测的靶基因有新型冠状病毒 2019-nCoV 的 ORF1ab、N 基因和 E 基因、甲型/乙型流感病毒FluA/B、内标基因

 ◆  荧光标记对应的靶基因分别是

“FAM” 标记 “新型冠状病毒E基因和N基因”

“VIC”  标记 “内标基因（MS2）”

“ROX” 标记 “新型冠状病毒ORF1ab”

“CY5” 标记 “甲型/乙型流感病毒FluA/B”

  ◆  内标选取非人基因组非试剂盒检测靶标的其他物种序列设计内标引物探针 MS2 基因（外源性内标）

第二步，通过【主要组成成分】确认：

 ◆  配制试剂体系的组成

 ◆  阳性对照、阴性对照的成分

例如，图片中上、下图展示：我们可以了解到，这两款试剂盒的阴性对照成分不同

◆  上图中，阴性对照的成分只有无核酸酶水

◆ 下图中，阴性对照的成分含有内标片段（RNase P基因）

阴性对照中的成分不同，起到的监测功能不同，只有无核酸酶水的阴性对照可以监控提取及扩增过程中是否有污染；而含有内标基因的阴性对照则通过内标基因的检测Ct值来监测提取及扩增过程中内标基因的效率。

第三步，通过【检验方法】确认：

◆  检测的反应体系：扩增试剂体系量+核酸样本量

◆  阳性对照、阴性对照的处理方式：需要核酸提取 or 直接加样扩增

◆  扩增检测参数设置

其中，扩增检测参数设置环节，非常重要，关乎“结果分析” ！

例如，图片展示：我们可以了解到这款试剂盒

Step1：逆转录—将RNA逆转录为cDNA

Step2：预变形—激活Taq酶（DNA聚合酶）

Step3：变性、退火、延伸—PCR工作原理

荧光信号采集从Step3开始。

第四步，通过【检验结果解释】确认：

◆  阳性判断值

◆  质量控制

◆  结果判读

常见案例 · 解析

回到本文开头的那个问题：

同为新冠病毒核酸检测试剂盒，最低检出限一致的情况下，结果判读的标准中Ct值相差较大，是为哪般？

换个问法：某实验室用A、B两家公司的试剂检测同一份核酸样本，发现：A试剂检测结果Ct值较B试剂检测值低10左右，分别重复试验结果仍然相差10左右。是否说明A试剂的敏感性要高于B试剂？

解决方案：

遇到这个问题，我们首先要比对一下A、B两家试剂盒的说明书。

通过比对两家试剂盒说明书的【扩增检测参数设置】，我们可以发现：

1. 试剂A前10个扩增循环没有进行荧光信号的收集

2. 试剂B比试剂A扩增循环数多3个循环

因此，在比较A、B两家公司试剂的检测结果时，应在试剂A检测结果Ct值的基础上加10。最终A、B试剂的检测结果基本一致。

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