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小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritic，Pst)引起的世界小麦生产中最为重要的病害之一，具有分布广泛，大面积爆发流行的特点。而培育持久抗性品种是防治小麦条锈病最为经济有效的措施，其中鉴别并利用优异抗源则显得尤为重要。小麦抗条锈病基因Yr5是目前国内外少有的对几乎所有条锈病菌系具有抗性的抗条锈病基因，在小麦抗条锈病育种中具有重要的应用价值。 1. Yr5、Yr7和YrSP发现及历史 Macer(1963)首次在斯卑尔脱小麦中发现一个苗期表达的显性抗条锈病基因，命名为Yr5。随后Law(1976)通过单体分析将Yr5基因定位到2B染色体长臂，距离着丝粒21 cM的遗传距离。Wellings和McIntosh(1990)和Nagarajan等(1986)利用世界范围内条锈菌生理小种对Yr5进行鉴定，除了少数澳大利亚和印度的条锈病菌小种，Yr5均表现高抗及免疫。Kema(1992)发现Yr5基因在多个斯卑尔脱小麦品种均存在，并且对欧洲条锈菌生理小种具有很好的抗性。 Yr7是Macer在硬粒小麦Lumillo品种中发现并命名，并且将其导入到普通小麦中。Johnson(1969)将Yr7定位在2B染色体，并将携带Yr5和Yr7两个基因的品种杂交之后，后代并无抗条锈性分离情况，推测Yr7与Yr5可能是等位基因或者紧密连锁的关系。后来，McIntosh(1981)发现Yr7同Sr9g紧密连锁，距离着丝粒20 cM的遗传距离。 小麦品系Spaldings Prolific是国际小麦条锈菌鉴别寄主，Johnson(1972)发现其含1个显性抗条锈病基因。Gosal(2000)将来源Spaldings Prolific的抗条锈病基因定位在2B染色体上。McDonald等(2004)将Spaldings Prolific中含有的抗条锈病基因命名为YrSp。 可以看出对于这3个位于2BL染色体相近区间的抗条锈病基因的研究已有悠久历史。为确定这3个基因的连锁关系和抗谱差异，Zhang等(2009)利用Yr5和Yr7导入感病材料的近等基因系进行等位性测验，通过对杂交后代抗条锈病表型分离比率同样证明了Yr7与Yr5可能是等位基因或者紧密连锁。Feng等(2015)发现YrSp基因位点与Yr5和Yr7均紧密连锁，利用10个条锈菌生理小种对Yr5、Yr7和YrSp进行多小种鉴定，发现3个抗条锈病病基因的抗谱有所差异。 2. Yr5、Yr7和YrSP的分子标记定位 最早开展小麦抗条锈病基因Yr5分子标记研究的是中国农业大学和中国农业科学院植物保护研究所。魏艳玲在中国农业大学孙其信教授团队攻读硕士学位时发现2B染色体上的SSR标记Xgwm510与Yr5连锁(Sun et al. 2002)。中国农业科学院植物保护研究所麦病室同期利用RAPD技术对Yr5进行定位，发现3个与Yr5连锁的特异性DNA扩增片段，其中S1496761与Yr5紧密连锁，遗传距离为2.7 cM，并经克隆测序转化为SCAR标记SC-S496761。之后，美国Washington State University的Chen Xianming实验室利用抗病基因同源序列(Resistance gene analog, RGA)开发出与Yr5共分离的RGAP标记Xwgp-17和Xwgp-18(Yan et al. 2003)，他们还根据Xwgp-17和Xwgp-18的序列开发出便于操作的STS和CAPS标记(Chen et al. 2003)。后来利用AFLP技术继续开发与Yr5连锁的分子标记，发现Yr5基因位于NBS-LRR类型基因簇中(Smith et al. 2007)。 3. Yr5、Yr7、YrSP克隆 英国JIC的Uauy和Wullf博士课题组联合澳大利亚悉尼大学McIntosh和张鹏博士以及CSIRO的Lagudah博士实验室利用MutRenSeq技术成功克隆出Yr5、Yr7和YrSp基因(Marchal et al. 2018)。他们首先通过对3个抗病基因材料进行EMS诱变，分别筛选出10、9和4个感病突变体。利用MutRenSeq技术进行突变体中的NLR类型基因捕获测序，经分析之后分别获得了3个候选contig，根据RNA-Seq分析结果，每个Contig均含有一个ORF，编码BED-NLR蛋白。这23个突变体材料经Sanger测序验证均存在单碱基突变产生的氨基酸替换，或由于拼接位点改变，或产生提前终止。三个候选基因及其中国春中的同源基因均位于相同的遗传定位区间内。 图2 Yr5、Yr7和YrSp的克隆(Marchal et al. 2018) 如图2所示，Yr5、Yr7和YrSp这3个基因有着相似的外显子和内含子基因结构。其中YrSp由于第3个外显子的单碱基缺失导致提前终止，从而使其ORF长度减少。Yr5和Yr7的全长DNA序列有着77.9%的一致性，而YrSp是一个截断的Yr5，二者之间有着99.8%的序列一致性。所以推测Yr5和YrSp来源于同一个序列或为等位基因，而Yr7则为旁系同源基因。根据这Yr5、Yr7和YrSp基因的序列特征，开发了这3个基因的功能性标记，可以应用于分子标记辅助选择育种。 等位变异分析表明，小麦品种Cadenza和Paragon中含有Yr7，与其系谱中含有Yr7基因供体硬粒小麦品种Iumillo和普通小麦Thatcher一致；四倍体小麦Svevo、Kronos和Zavitan中均不含有Yr7。小麦品种Claire中含有一个完整的Yr5型NLR，与Yr5相比，在C端存在6个多态性氨基酸变异；小麦品种Robigus、Paragon和Cadenza中都含有完整的Yr5型NLR，C端除了具有Claire中的6个多态性氨基酸变异外，在BED和NB-ARC结构域还存在19个氨基酸替换。Cadenza中同时含有Yr7和Yr5/YrSp，进一步表明Yr7与Yr5/YrSp不是等位基因，而可能是Duplication产生的旁系同源基因。而其他品种与Yr5间在C末端的差异是靠近3’端有一个774 bp的插入，导致提前终止。四倍体小麦品种Kronos和Svevo编码Yr5/YrSp的第五种单倍型，为截短的LRR，但与YrSp不同，在C末端存在大量的氨基酸替换。这种截短的单倍型与YrSp类似，在Kronos中表达。但Claire、Robigus、Paragon、Cadenza、Svevo和Kronos等品种均不抗条锈病，表明这些氨基酸替换和结构域的截短影响了其蛋白功能和病原菌的识别。 对于Yr5、Yr7和YrSp这3个基因编码蛋白的分析发现，它们的N端均含有包含锌指BED结构域的DNA结合区域，随后是NB-ARC结构域(图3)。区别于其他已经克隆的麦类作物抗病基因如Mla10、Sr33和Pm3等，Yr5、Yr7和YrSp编码的抗病蛋白缺失CC结构域。并且只在Yr5和Yr7的C端存在完整LRR结构域，而YrSp由于提前终止缺失了大部分LRR结构域，但仍具有抗条锈功能，且与Yr5抗谱不同。非常有意思的是所有对YrSp有毒性的条锈病菌系都对Yr5无毒性，而2个对Yr5有毒性的条锈病菌系却对YrSp无毒性。Yr5、Yr7和YrSp蛋白在N端相当地保守，仅在BED结构域存在一个氨基酸改变，而这种保守性在BED结构域的下游逐渐下降。BED结构域对于条锈病抗性十分必要，Yr7基因BED结构域一个氨基酸的突变会导致其感病性。由于Yr5和YrSp具有完全相同的BED结构域，但二者抗谱不同，因此，BED结构域与小种的专化抗性无关。 图3 Yr5、Yr7和YrSp蛋白结构图(Marchal et al. 2018) 4. Yr5、Yr7和YrSP育种利用 Zhan等(2016)用6000个小麦条锈菌生理小种进行多小种鉴定发现只有其中的两个小种对于Yr5具有毒性，表明Yr5具有持久广谱抗性，而Yr7和YrSp目前已丧失对部分条锈病菌的抗性。为了延长Yr5基因在育种和生产上的使用时间，需要不断进行多个抗条锈病基因的累加，如美国UC Davis的育种计划中是对Yr5和Yr15进行聚合。而国内Yr5基因也表现突出的条锈病抗性(图1)，在西南和西北麦区均有应用，部分兰天系列小麦品种中的条锈病抗性可能源于Yr5。Zhang等(2019)发现抗白粉病基因Pm64与Yr5互斥连锁，目前我们已经通过增大分离群体，借助分子标记辅助选择筛选该基因组区域的重组个体，辅助以白粉病和条锈病菌人工接种苗期和田间成株期鉴定，创制出了Pm64与Yr5发生重组且呈紧密连锁的兼抗白粉病和条锈病新种质(图4)。 参考文献
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