【原】细胞转染实验注意事项有哪些？

本实验室常用invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine2000。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。Lipofectamine2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。）混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。在室温保温20分钟。 注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基。在37℃，5％的CO₂中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

注意事项：

1.     健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性：通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。

2.     通过合适的阳性对照优化转染和检测条件：对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。或用空载质粒转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。

3.     即使Lipofectamine2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做Lipofectamine2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。

4.     如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。