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基因编辑细胞实验，看这篇就够了！特别是在基因功能研究中，常常会用到CRISPR-Cas9技术，例如构建基因敲除、基因定点突变和基因敲入的细胞等，方便和高效的标签已经牢牢贴在它的身上。基因敲除（Knock out，KO）是基因功能研究中的“减法”套路，也就是基因功能缺失的研究思路，当目的基因被敲除，基因功能丧失后，所出现的细胞表型变化我们便... 阅213 转2 评0 公众公开 22-02-07 09:05 |
[原]细胞稳转株构建方法 细胞稳转株构建方法病毒法① 确定目标细胞系的相关信息，细胞的培养条件，细胞的增值速度，支原体污染情况；② 预实验确定MOI值，可通过查阅文献确定慢病毒在目标细胞系中的MOI值也可参考查阅得到的数据，设计梯度实验，摸索最适MOI；④ 细胞铺板，将需要的细胞量接种于合适的培养皿中；⑤ 细胞感染，通过接种的细胞量及预实验得来的MOI来计算... 阅58 转3 评0 公众公开 22-01-06 09:32 |
基因敲除细胞系(株)鉴定方法？CRISPR/Cas9的作用过程主要分为两个阶段，第一阶段，捕获外源引入的序列（对于常用的CRISPR/cas9系统来说，第一阶段是sgRNA和Cas9蛋白结合）；一般我们会选用蛋白法来做，直接合成sgRNA单链，和Cas9蛋白在体外孵育形成RNP复合物，在通过电转的形式将RNP复合物导入细胞中，这样既在较短时间内获得纯合敲除的单克隆... 阅146 转5 评0 公众公开 21-12-03 09:29 |
对感染并筛选后的混合克隆稳转株细胞进行稀释培养，挑取单一细胞生长而成的细胞克隆，再进行扩大培养，以获得性状单一、表达稳定的细胞株：1）将细胞消化后接种于96孔板中，接种的细胞密度为1个/孔（可通过有限稀释的方法，也可通过流式分选）；2）标记出具有单个细胞的孔等细胞扩增后用puro进行筛选；细胞计数设定首排的浓度，例如首孔设置10*... 阅703 转5 评0 公众公开 21-11-25 09:13 |
处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成 3-5×104个/mL细胞悬液，并根据表1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右，按照预实验结果，参考表1更换感染培养基，加入最适病毒量进行感染。按照预实验确定的感染条件，使用感染液将细胞制成 3-5×105个/mL悬液，并根据表2接种相应的细胞数到培养板中。... 阅63 转2 评0 公众公开 21-11-25 09:12 |
慢病毒介导的稳转株筛选原理。筛选流程示意图。实验原理：通过将外源DNA/shRNA克隆到带有某种抗性基因的载体上，重组载体转染至宿主细胞并整合到其染色体中，并随细胞分裂稳定传递，最后用载体中所含抗性基因进行筛选。抗性选择：常用的真核表达载体抗性筛选标志物有嘌呤霉素(puromycin)、新霉素(neomycin)和杀稻瘟菌素（blasticidin)。 阅72 转2 评0 公众公开 21-11-25 09:11 |
而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同... 阅310 转2 评0 公众公开 21-11-16 09:44 |
稳定表达细胞株的构建注意事项。1. 长期在目的细胞中研究基因功能，通过构建稳定株，可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本，也极大方便实验研究；3. 瞬转往往会引入极高拷贝数的表达，导致因为人为因素造成实验结果的不精确，构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究；5. 需要用细胞做动物实验的，比如裸鼠成瘤等，往往需要构建... 阅35 转2 评0 公众公开 21-11-16 09:35 |
[原]稳定表达细胞株的构建流程 慢病毒过表达载体有基因容量限制，对于大于5k的基因，包装出慢病毒的概率很低，不建议包装病毒。慢病毒载体带有不同的标签，如果研究细胞定位，可以选择带荧光标签的慢病毒载体，比如带GFP/RFP等；感染期间请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液，以保证细胞良好的生长状态。反复冻融会降低病毒滴度，每次冻融会降低病毒滴度10%，因此，在病... 阅246 转2 评0 公众公开 21-11-16 09:34 |
构建稳定表达细胞株的基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含抗性基因进行筛选，可得到稳定表达目的蛋白、或者稳定表达沉默特定基因的细胞株，即稳转株。而慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后容易整合到受感染细胞的基因组，进行长时间稳定表达，因此，慢病毒是... 阅417 转2 评0 公众公开 21-11-16 09:32 |
