【原】混合克隆稳转株的构建技术原理

1. 目的细胞病毒感染

处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成 3-5×10⁴个/mL细胞悬液，并根据表1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右，按照预实验结果，参考表1更换感染培养基，加入最适病毒量进行感染。参照预实验结果，选择感染后最适时间点更换为常规培养基继续培养，一般为感染后8-16h左右。

表1.贴壁细胞接种和病毒感染时的体积

按照预实验确定的感染条件，使用感染液将细胞制成 3-5×10⁵个/mL悬液，并根据表2接种相应的细胞数到培养板中。铺板后无需培养，参照预实验确定的 MOI 加入最适病毒量感染。参照预实验结果，选择感染后最适时间点，一般为 8-16h 左右，将各孔中细胞收集到干净的 1.5 ml EP 管中，以 1300 rpm 离心 2 min，去掉上清液，更换为完全培养基，轻轻混匀后放回培养板中继续培养。

表2.悬浮细胞接种体积

2. 感染后细胞加入抗生素筛选

1）感染 72h 后，观察细胞状态和感染效率。要求细胞状态良好，未出现大量死亡现象，特别是保证 NC 组与 CON 组细胞状态相当。

2）加入合适浓度的抗生素，筛选至少 48h。如病毒载体带有荧光标记，荧光效率需要达到 100%后，降低抗生素维持浓度（相较之前的药筛浓度，浓度减至之前浓度的 1/2~1/4 或更低）继续对感染后的细胞进行筛选和扩增，同时收集细胞进行下游 qPCR 检测（鉴定目的基因表达水平）。

3. 细胞扩增、冻存、复检

1）将加入抗生素维持浓度的细胞继续进行扩增。待 qPCR 检测结果合格后进行冻存，保证每株细胞至少冻存 6 支。

2）冻存2-3天后，任意复苏一支，判断复苏细胞状态。