  解螺旋公众号·陪伴你科研的第2713天 细胞死亡新热点！ NETosis是中性粒细胞的炎性细胞死亡方式。活化的中性粒细胞通过向细胞外释放由解聚的染色质和细胞内颗粒蛋白组成的细胞捕获网（neutrophil extracellular traps，NETs），以捕获和杀死病原体。在NETs形成过程中伴随着中性粒细胞的死亡，这种新型的死亡方式不同于细胞凋亡和细胞坏死，被称为NETosis。 而最近，美国学者总结了这一新型的细胞死亡方式的细胞机制，并将其于2020年发表在Annual Review of Cell and Developmental Biology期刊上。Annual Review of Cell and Developmental Biology期刊是生物学的1区TOP综述期刊。截至2021年9月2日，就是在本文发表未到1年的时间里面，本文已被引用21次（数据来源：PubMed）。今天就让我们来一起看一下NETosis的细胞机制。 摘要 中性粒细胞对先天免疫至关重要，包括宿主防御细菌和真菌感染。它们通过吞噬病原体、分泌充满细胞毒酶的颗粒或在坏死过程中排出中性粒细胞捕获网（NETs）来实现宿主防御作用，这一过程叫做NETosis。网状结构是由激活的中性粒细胞释放的组蛋白和抗菌蛋白修饰的网状DNA结构。最初被描述为中性粒细胞中和病原体的一种手段，NET释放也发生在无菌炎症中，促进血栓形成，并可介导组织损伤。 为了有效地利用这把双刃剑来对抗特定的疾病，研究人员必须致力于了解导致NETosis的机制。只有深入了解该机制，研究人员才能根据需要开发新的药物来促进或预防NETosis发生。虽然关于NETosis的病理生理作用的知识正在积累，但对这一过程的细胞和生物物理基础知之甚少。在这篇综述中，我们描述并讨论了我们目前对介导NET释放的分子、细胞和生物物理机制的认识以及该领域的开放性问题。 引言 中性粒细胞对宿主防御至关重要。例如，中性粒细胞数量较少的患者会反复出现细菌和真菌感染，并且在清除此类感染方面存在缺陷。成熟的中性粒细胞在骨髓中由粒细胞-单核细胞前体细胞分化而来，其特征是胞浆中存在颗粒和多分叶状核。 NETs被释放到循环中，在那里它们可以被激活的内皮细胞、常驻免疫细胞和受损的上皮细胞招募到无菌和病原体诱导的损伤部位。一旦它们到达损伤部位，中性粒细胞表面受体与促炎症信号（如细菌成分、真菌β-葡聚糖或细胞因子）的结合会诱导信号级联反应，从而增强中性粒细胞效应器功能（如激活）。活化的中性粒细胞可通过脱颗粒释放其颗粒，通过吞噬作用内化和降解病原体，并释放NETs，从而中和入侵者。中性粒细胞分化、迁移至损伤部位、脱颗粒，吞噬作用已有相关综述。在这里，我们重点关注NETs的释放过程。 1 NETs NETs由解聚的染色质构成，形成网状DNA结构，具有约30 nm的孔。它们被核蛋白包裹，包括组蛋白、颗粒蛋白（如中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶）和胞浆蛋白（如S100钙结合蛋白A8、A9和A12，以及肌动蛋白和α-肌动蛋白）。除中性粒细胞外，嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞都可以在刺激时释放细胞外DNA。NETosis最初被描述为不同于凋亡和坏死的程序性细胞死亡途径，NETs的释放也被认为是不发生细胞溶解的情况下发生的。 2 NETosis是一把双刃剑 Brinkmann及其同事的开创性工作首次报告了活化的中性粒细胞将核DNA释放到细胞外环境的能力，在细胞外环境中，它可以捕获并中和病原体，这一过程被称为NETosis。各种病原体诱发NETosis的能力，以及NETs能够捕获和杀死细菌、真菌以及限制HIV-1病毒感染都表明NETosis可能对先天免疫很重要。然而，NETs也会在无菌炎症中形成。此外，与NETs相关的细胞毒性蛋白质能够损伤宿主细胞和激活血小板，以及自身免疫性疾病患者NETosis期间释放的抗蛋白质自身抗体的存在，说明了NETosis是一把双刃剑。 虽然已经证明了NETosis的病理生理相关性，但NETosis的细胞机制才刚刚开始被揭示。对于由细胞核、颗粒和胞浆内容物修饰的解聚DNA，要在细胞外释放，该过程必须在细胞外或细胞内进行初始化；染色质必须解聚并从细胞核释放；细胞骨架、细胞器、细胞内、细胞核以及质膜都必须重塑。在下文中，我们将回顾我们目前对这些细胞步骤的了解。 NE Tosis的发生 虽然引发NETosis而非其他中性粒细胞反应的主要信号仍然未知，但NET释放开始于表面受体的激活，随后是细胞内钙浓度的变化、激酶信号级联的激活和活性氧（ROS）的产生。这些最初的信号事件转化为形态变化，特别是细胞扩散的增加和细胞形状的变化。在下文中，我们将讨论这些早期信号和细胞事件。 1 中性粒细胞活化是先决条件 NETosis需要中性粒细胞活化。因此，在非炎症状态下静止的中性粒细胞不会发生NETosis。此外，缺乏TLR2或补体成分3的小鼠的中性粒细胞，以及更一般而言，缺乏IL-1-受体/TLR信号[MyD88敲除]的小鼠在金黄色葡萄球菌刺激下不会释放NET。据报道，GPCR、TNF和Fc受体可诱导NETosis，表明这些受体可能参与NETosis的发生。虽然CD18（β2整合素）对于钙内流、PMA、唾液粘蛋白或外源性H2O2诱导的NETosis是不必要的，但对于活化的血小板、金黄色葡萄球菌和汉坦病毒诱导的NET释放是必需的。 除质膜表面受体外，NOD样受体蛋白3的激活也可引发NETosis。离子霉素和尼日利亚霉素等细菌毒素以及活性氧（ROS）可诱发NETosis，可能不激活表面受体。因此，中性粒细胞的激活，无论是通过细菌毒素还是通过表面受体的参与，都会引发NETosis。 2 NETosis中的钙峰 中性粒细胞活化导致细胞内钙浓度增加。例如，GPCR、Fcγ受体、TLR4和补体受体（β2整合素）上的配体结合触发内质网（ER）储存钙的释放，随后打开质膜钙通道。在NETosis的情况下，在脂多糖（LPS）、IL-8和PMA刺激的中性粒细胞中观察到细胞内钙的增加，并且用钙离子载体离子霉素和A23187治疗导致NET释放。更重要的是，细胞外钙螯合作用抑制IL-8、PMA、铜绿假单胞菌、离子霉素和nigericin刺激的NETosis，而细胞内钙螯合作用损害IL-8、PMA和nigericin诱导但非白色念珠菌或B组链球菌诱导的NETosis。 因此，细胞内钙的增加，无论是通过释放细胞内储存物还是从细胞外环境流入，对NETosis都很重要。然而，人们对NETosis期间需要钙的细胞过程知之甚少。已知由钙介导的一种途径是通过PAD4，这是一种对NETosis至关重要的酶，需要高浓度的钙才能激活。因此，进一步确定钙增加的机制和钙在NETosis的细胞靶点对于理解钙如何调节NET释放至关重要。 3 激酶在NETosis中的作用 钙内流下游激活的两种激酶或细胞因子参与以及细胞周期的调节因子均与NETosis有关。磷脂依赖性、佛波酯和钙激活的关键细胞周期调节因子激酶、蛋白激酶C（PKC），特别是PKCα、PKCβ1和PKCζ，介导PMA、离子霉素、IL-8、血小板激活因子、白色念珠菌和B组链球菌引起的NETosis。调节细胞周期G1/S转换的细胞周期素依赖性激酶6和Raf-MEK-ERK-MAP激酶途径对PMA诱导的NETosis至关重要，而SYK-PI3K-mTorc2途径介导尿酸单钠晶体和金黄色葡萄球菌引起的NETosis。 最后，JAK2最近被认为与NETosis有关，它能转导细胞因子介导的信号并控制细胞增殖。事实上，导致癌症的JAK2中的激活突变也增加了NETosis的倾向。然而，与钙类似，PKC、Raf-MEK-ERK和SYK-PI3K-mTorc2通路的需要依赖于NETosis兴奋剂。因此，在受体激活和/或钙内流的下游，与细胞周期调节有关的几种激酶介导了NETosis。确定其下游效应物对于设计治疗NETosis的药物至关重要。 4 NADPH氧化酶：活性氧的作用 尽管活性氧的产生传统上被认为是通过氧化损伤杀死病原体的直接机制，活性氧在NETosis的信号传导中也起着核心作用。中性粒细胞中ROS的两个主要来源是NADPH氧化酶和线粒体。用PMA、A23187、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌或B组链球菌刺激中性粒细胞可导致活性氧产生快速（20分钟内）增加。重要的是，慢性肉芽肿性疾病患者中缺乏功能性NADPH氧化酶的中性粒细胞在金黄色葡萄球菌或PMA刺激下不能发生NETosis。然而，NADPH氧化酶介导的ROS对于多诺瓦尼利什曼原虫等刺激的NETosis不是必需的。因此，与对钙和特异激酶的需求类似，ROS和NADPH氧化酶在NETosis中的重要性似乎取决于刺激。NADPH氧化酶驱动NET释放的确切机制尚不清楚。 5 细胞形态动力学 NETosis的发生伴随着细胞重排。在体外刺激NETosis后，中性粒细胞在脱落质膜微泡和聚集之前在基质上扩散。细胞扩散的最初增加表明细胞表面细胞外基质（ECM）受体（如整合素）的激活。尽管整合素激活发生在中性粒细胞激活过程中，并促进NETosis，但取决于刺激，沉积在缺乏整合素配体的表面上的中性粒细胞在PMA刺激下仍会发生NETosis。这表明NETosis本身可能不需要细胞扩散和integrin参与。 扩散后，粘附细胞中的NETosis通过脱落膜联蛋白V阳性的质膜微泡（图1）进行，其中含有包括颗粒在内的胞浆成分。除了微泡脱落外，中性粒细胞在初始扩散后也会聚集，类似于正在进行有丝分裂的贴壁细胞。而质膜微泡脱落和聚集可能导致有效细胞表面积减少，这些形态学变化是否是NETosis进展所必需的尚不清楚。 尽管如此，在NETosis发病时脱落的微泡还是非常有趣的：它们可能是诱导系统效应的信使，例如促进血栓形成。此外，膜联蛋白V-阳性微泡的命运可能与膜联蛋白阳性凋亡细胞相同，并被巨噬细胞内化而不引起炎症。这些微泡中的颗粒蛋白也可能对病原体和宿主细胞产生毒性作用。中性粒细胞微泡已被证明可限制细菌生长，诱导内皮细胞分泌细胞因子，激活血小板，并下调巨噬细胞的活化，尽管尚不清楚这种中性粒细胞衍生的小泡是否是通过NETosis产生的。然而，人们很容易推测，在NETosis发病时，微泡脱落可能参与NETosis的杀菌功能，同时抑制炎症。需要进一步的研究来揭示在感染和无菌性炎症下形成的微泡的作用，并阐明其释放的分子机制。 6 开放性问题：NETosis启动 目前尚不清楚，为什么触发吞噬或去颗粒作用的同一表面受体的激活也会导致NETosis。病原体的大小已被认为是NETosis的关键决定因素：当病原体太大而无法吞噬时，中性粒细胞会重新释放NETs。然而，许多小的细胞外甚至细胞内病原体，包括病毒，也能诱发NETosis。的确，C. albicans在被中性粒细胞吞噬后可引发NETosis。 最近有人提出，较年轻的中性粒细胞中较高的颗粒计数使其比颗粒较少的较年长的中性粒细胞更容易发生NETosis，这表明颗粒的数量可能决定中性粒细胞对未发生NETosis的易感性。然而，这与循环中老化的中性粒细胞更容易形成NETs的观察结果不一致。此外，在系统性红斑狼疮（SLE）或银屑病患者中发现的低密度颗粒细胞以其颗粒含量低为特征，但会自发形成NETosis。因此，颗粒数量可能不是NETosis决策的关键因素。研究什么因素决定了对刺激的反应何时发生NETosis，决定是否取决于刺激的浓度或细胞的激活状态，将为我们更好地定义NETosis的生理意义提供见解。 NE Tosis中DNA解聚的机制 与其他细胞死亡过程（如凋亡、坏死或焦亡）相比，染色质解聚是NETosis的主要特征，在这些过程中，染色质要么没有改变，要么变得浓缩。在NETosis形成过程中，染色质解聚的特点是染色质异质性的丧失（图1和2），表明异染色质丢失，以及DNA占据的细胞空间增加。与DNA转录的染色质解聚类似，NETosis中的染色质解聚被认为是由组蛋白翻译后修饰介导的。尽管最近的证据表明乙酰化参与了，但NETosis期间最具特征的组蛋白修饰是由PAD4介导的瓜氨酸化和由丝氨酸蛋白酶介导的裂解。在下文中，我们将讨论这些不寻常的组蛋白修饰，以及它们如何驱动染色质去凝聚和NETosis。 1 PAD4、组蛋白瓜氨酸化、染色质去凝聚和NETosis PAD4目前被认为是通过瓜氨酸化组蛋白来驱动NETosis。这通过减少组蛋白和DNA之间的静电相互作用来诱导染色质解聚。 1. PAD4和组蛋白瓜氨酸化 瓜氨酸化是一种翻译后修饰，将精氨酸转化为瓜氨酸，导致正电荷损失、质量轻微下降和氨释放。PAD构成了一个催化瓜氨酸化的蛋白质家族。在哺乳动物中表达的五种PAD类型中，PAD4主要在粒细胞中表达，是唯一含有常规核定位信号的类型。尽管已经报道了PAD4胞浆活性，但直接可视化显示，PAD4主要定位于静止中性粒细胞的细胞核。PAD4介导精氨酸2、8、17和26处核小体组蛋白H3的瓜氨酸化，精氨酸3处的H4和H2A，以及精氨酸54处的连接组蛋白H1。PAD4瓜氨酸化组蛋白和修饰组蛋白-DNA相互作用的能力表明其在转录调节中的作用。 因此，据报道，PAD4与启动子相关，其表达水平与包括小鼠胚胎干细胞（MESC）中Tcl1和Nanog在内的几个关键多能性基因的转录相关。PAD4具有瓜氨酸化组蛋白的能力及其在粒细胞中的特异性表达使其成为介导核变性过程中染色质解聚的完美候选。 2. PAD4在染色质解聚和NETosis中的作用 各种研究的结果一致认为PAD4在NETosis中起着关键作用。PAD4敲除小鼠的中性粒细胞不显示瓜氨酸化组蛋白H3，也不经历PMA、LPS、福氏志贺氏菌、钙离子载体、金黄色葡萄球菌感染诱导的NETosis。在无菌炎症期间，如深静脉血栓形成和癌症，PAD4也被证明是NETosis所必需的，其表达水平在糖尿病等慢性疾病中上调。PADs的药理抑制可消除组蛋白瓜氨酸化，并减少NET释放。然而，这些抑制剂的特异性存在疑问。最近，有研究表明，在离子霉素刺激下，具有PAD4基因断裂的嗜中性粒细胞样人类HL60细胞无法快速解聚其染色质或释放NETs，这表明PAD4可能对人类和小鼠的NETosis至关重要。 尽管有很多证据表明PAD4与NETosis有关，但认为它是一种普遍要求的观点受到了挑战。据报道，PMA诱导的NETosis在没有组蛋白H3瓜氨酸化的情况下发生。此外，据报道，PAD的药理抑制作用对PMA等诱发的NETosis无作用。而C. albicans诱导的NETosis与组蛋白瓜氨酸化相关，但仍发生在PAD4敲除小鼠中。这些数据表明，PAD4对NETosis的需求可能因NETosis刺激而不同。 PAD4在NETosis期间是如何激活的？ PAD4是一种钙特异性酶，包含五个钙结合位点；其体外激活需要高钙浓度（>100μM至mM范围），最佳pH值为7.6。然而，据报道，活化中性粒细胞中的细胞内钙浓度处于低微摩尔范围（0.7μM），远低于体外PAD4活化所需的水平，这表明必须存在增加细胞内钙的NETosis特异性机制或替代PAD4激活途径。活性氧可以激活PAD4，然而，缺乏直接证据。因此，了解NETosis期间PAD4的激活需要更好地了解中性粒细胞钙调节的细胞机制。 PAD4如何介导染色质解聚和NETosis？ 目前该领域的模型是，PAD4介导的瓜氨酸化导致组蛋白正电荷减少，从而降低组蛋白与带负电荷DNA之间的亲和力，导致组蛋白与DNA分离，从而导致紧密染色质结构的丢失和去凝聚。根据这一概念，PAD4缺陷的中性粒细胞在去除染色质密度方面效率较低。回复实验表明，PAD4核定位和酶活性是有效染色质解聚所必需的，表明核中的PAD4瓜氨酸化活性介导了核变性。 有证据表明PAD4可以直接解聚染色质。来自PAD4激活细胞的DNA被微球菌核酸酶降解得更快，这表明连接体DNA更容易被切割，因此染色质浓缩程度较低。mESCs中的PAD4瓜氨酸化组蛋白H1与染色质分离并影响染色质凝聚。这些数据表明，PAD4通过抑制连接子组蛋白介导的致密化来介导染色质去致密化。链接器组蛋白瓜氨酸化已在MESC中得到证实，但是否发生在NETosis需要进一步研究。更重要的是，需要对非瓜氨酸化组蛋白突变体进行实验，以直接证明组蛋白瓜氨酸化介导染色质去凝聚。 虽然PAD4似乎对染色质解聚至关重要，但其他因素可能有助于在NETosis实现染色质完全解聚。虽然PAD4在非中性粒细胞类型中的异源表达导致它们在离子霉素刺激下排出去浓缩的染色质，但经PAD4蛋白处理的分离的中性粒细胞核的核面积仅轻微（20%）增加。此外，在PAD4缺陷的中性粒细胞样HL60细胞中，染色质解聚被延迟但不被抑制。这表明，可能需要额外的因素来达到染色质解聚的程度。因此，在人类中性粒细胞中，PAD4可能不足以使染色质解聚，或者在解聚的特定阶段（如起始阶段）可能需要PAD4，而完全解聚需要与其他细胞因子合作。 开放性问题：NETosis中的PAD4 PAD4在NETosis中的意义在小鼠和人类细胞中都得到了充分的认识，然而，仍然存在许多问题。在体内病理生理条件下，PAD4是如何激活的？体内激活PAD4所需的钙浓度及其产生机制是什么？PAD4是否经过翻译后修饰以调节其激活阈值？PAD4是否仅通过组蛋白瓜氨酸化来驱动染色质解聚，还是其他PAD4底物参与了该过程？对这些问题的回答不仅将阐明在NETosis过程中染色质脱凝的过程，而且还将揭示对组蛋白-DNA相互作用调节的基本机制的新见解。 2 蛋白酶与NETosis中染色质解聚 蛋白酶是中性粒细胞功能的核心。例如，它们介导吞噬体内和细胞外环境中的细菌杀死，并通过切割ECM促进中性粒细胞迁移。中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶3（PR3）和组织蛋白酶G（均包含在初级颗粒中）以及钙蛋白酶（一种细胞溶质蛋白酶）均与NETosis有关。 1. 初级颗粒驻留蛋白酶的作用 初级颗粒驻留丝氨酸蛋白酶对NETosis至关重要。事实上，中性粒细胞弹性蛋白酶和PR3可以诱导分离细胞核中的染色质解聚，这是通过DNA表面积的增加来实现的。抑制中性粒细胞弹性蛋白酶（与影响PR3的非选择性抑制剂一起）损害PMA诱导的NETs释放。当发现缺乏丝氨酸蛋白酶抑制剂SerpinB1的小鼠中性粒细胞在PMA、血小板活化因子、趋化因子配体2（cxcl2）或LPS等诱导的NETs释放时，证实了蛋白酶在NETosis中的重要性。此外，来自中性粒细胞弹性蛋白酶敲除小鼠的中性粒细胞不能发生NETosis。 虽然在NETosis中对丝氨酸蛋白酶的需求已被广泛接受，但中性粒细胞弹性蛋白酶对染色质解聚的具体需求仍存在争议。事实上，离子载体或唾液粘蛋白诱导的NETosis在没有中性粒细胞弹性蛋白酶活性的情况下进行。此外，中性粒细胞弹性蛋白酶缺陷小鼠的中性粒细胞在PMA或血小板活化因子刺激下仍会发生NETosis。 初级颗粒蛋白酶如何介导NETosis中染色质解聚？ 蛋白酶被认为通过组蛋白裂解介导染色质解聚和NETosis，从而从组蛋白中释放DNA。事实上，组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4在体外可被中性粒细胞弹性蛋白酶和PR3降解。此外，在PMA刺激的中性粒细胞中观察到H2B和H4的降解产物，抑制中性粒细胞弹性蛋白酶可防止PMA刺激的中性粒细胞中H4的降解。这表明中性粒细胞弹性蛋白酶对H4的切割对于NETosis期间染色质解聚至关重要。 由于中性粒细胞弹性蛋白酶、PR3和组织蛋白酶G定位于细胞质中的膜结合颗粒，因此它们在核内获得组蛋白的机制尚不清楚。PMA刺激30分钟后，中性粒细胞胞浆中检测到中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的瞬时活性，但未检测到PR3，这表明这些蛋白以活性形式在细胞内从颗粒中释放。这一发现导致了一个假说，即活性中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G首先释放到胞浆中，然后在核分裂期间转移到细胞核中。 蛋白酶如何使颗粒不渗透？髓过氧化物酶（MPO）和过氧化氢（H2O2）被认为介导蛋白水解活性中性粒细胞弹性蛋白酶从颗粒中释放；然而，相关机制仍需揭示。气孔形成蛋白gasdermin D与中性粒细胞弹性蛋白酶核易位有关。gasdermin D是否介导中性粒细胞弹性蛋白酶从颗粒中退出或进入细胞核仍有待确定。因此，丝氨酸蛋白酶介导染色质解聚的细胞机制仍有待研究。 开放性问题：NETosis中的初级颗粒驻留蛋白酶 尽管有证据表明蛋白酶与NETosis有关，但仍有许多未知因素。中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G如何以及何时与DNA共同定位？它们是否包含允许它们进入细胞核的核定位序列？它们是在核膜渗透或破裂之前还是之后进入细胞核的？更重要的是，中性粒细胞弹性蛋白酶对DNA有很强的亲和力，这被证明可以抑制其蛋白酶活性。这就引出了一个问题，在DNA存在的情况下，这种蛋白酶是如何介导H4裂解的？中性粒细胞弹性蛋白酶、PR3和组织蛋白酶G在NETosis期间的活细胞成像可以阐明它们在此过程中的作用。 2. 钙蛋白酶与NE Tosis中染色质解聚 一个有趣的新概念是，在NETosis期间染色质解聚可能是由PAD4介导的瓜氨酸化和蛋白酶介导的切割的组合效应引起的。因此，钙激活丝氨酸蛋白酶calpain在PAD4存在时可增强染色质解聚，但其本身不能增强染色质解聚。此外，抑制钙蛋白酶后，离子霉素诱导的NETosis会得到修复。因此，人们很容易推测PAD4介导的瓜氨酸化可以靶向核蛋白进行钙蛋白酶介导的降解，从而驱动染色质去凝聚。然而，需要进一步的研究来理解这种协同效应。 3 髓过氧化物酶的作用 MPO是一种主要的颗粒驻留蛋白，在过氧化氢存在的情况下催化氯化物氧化成盐酸，与核分裂期间染色质解聚有关。MPO缺乏患者的中性粒细胞在PMA刺激时不能释放NETs。有趣的是，对MPO的药理学抑制只会延迟NETosis，这表明有限的MPO活性足以引起NETosis。虽然MPO在体外不能直接解聚孤立核内的染色质或降解组蛋白，但它能增强中性粒细胞弹性蛋白酶介导的染色质解聚。MPO如何促进染色质解聚？它是否介导DNA氧化并阻断其对中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制作用？对因NETosis而受到刺激的MPO缺乏的中性粒细胞进行活细胞成像，将有助于确定哪个NETosis步骤受到抑制，从而确定MPO在NETosis释放中的作用。 DNA从细胞核释放到细胞质 要使解聚的DNA释放到细胞外，它必须首先从细胞核中逃逸出来。细胞核中的染色质通过核膜从细胞质中分离出来，核膜由两层脂质双层组成，由多蛋白复合物连接，包括核孔复合物（NPC）和核骨架与细胞骨架（LINC）复合物的连接物。在内层核膜（INM）下面是由层粘连蛋白A/C、B1和B2组成的层粘连蛋白中间丝网状结构。层粘连蛋白在基因表达中起主要作用，也被描述为分子减震器，这表明它们可以在到达染色质之前抑制细胞核外产生的机械力。 为了保护染色质不受核酸酶和机械力的影响，核膜长期以来被认为是非常稳定的，除了在有丝分裂期间，当有丝分裂激酶介导的层粘连蛋白分解和来自微管（MT）马达的拉力的联合作用驱动其断裂并随后将致密的染色质释放到细胞质中。然而，据报道，仅机械力就足以在限制下的免疫和癌细胞迁移过程中导致核膜破裂。 与细胞分裂和迁移过程中所描述的重排相似，在核分裂过程中DNA释放到胞质溶胶中被证明涉及层粘连蛋白重塑以及核膜破裂前形成孔。有趣的是，在没有核膜破裂的情况下，由于DNA解聚而在囊泡中离开细胞核，因此出现了重要的NETosis。在下文中，我们描述了参与细胞质中DNA释放的分子参与者，并讨论了染色质的机制如何驱动这一过程。 1 NETosis中的核纤层蛋白动力学 在NETosis期间，观察到核纤层蛋白网状结构发生了显著变化（图1和图2）。据报道，在PMA或离子霉素刺激的人和小鼠中性粒细胞中，核纤层蛋白B1和B2网络出现局部不连续性。Thiam及其同事利用离子霉素刺激的HL60衍生中性粒细胞的高分辨率活细胞成像，发现解聚的DNA从这些核纤层蛋白不连续处挤出。 核纤层蛋白在NETosis期间是如何分解的？网状结构不连续的形成可能是核纤层蛋白翻译后修饰的结果。因此，在PMA诱导的NETosis中，报道了核纤层蛋白A/C和PKCα介导的核纤层蛋白B1磷酸化。事实上，核纤层蛋白B1的PKC磷酸化位点突变与RAW264.7巨噬细胞的NETs释放有关。此外，在离子霉素诱导的NETosis过程中观察到核纤层蛋白B1降解，PAD4缺乏可延迟核纤层蛋白不连续性的形成，并减少离子霉素刺激的中性粒细胞中核纤层蛋白B1的降解。这表明PKC介导的核纤层蛋白磷酸化和/或PAD4介导的核纤层蛋白降解可在NETosis过程中驱动核纤层蛋白的分解。PKC是否磷酸化中性粒细胞中的核纤层蛋白B1以及PAD4如何驱动核纤层蛋白B1降解有待进一步研究。 2 NETosis中的核膜动力学 在自杀和致命性NETosis期间，核膜被认为会起泡。事实上，Fuchs及其同事利用电子显微镜检测到含有核纤层蛋白B受体（LBR）的小泡，该受体可能来自核膜。这导致了一个假说，即核膜的囊泡化介导其解体，从而允许染色质在PMA诱导的核分裂期间释放到细胞质中。但由于薄片伪影无法区分连续网络和不连续网络，这些结果尚不能很好解释。此外，LBR也存在于内质网中，通过活细胞显微镜观察到内质网形成囊泡，增加了观察到的LBR阳性囊泡可能来自内质网的可能性。 在生命垂死期，核膜被认为是泡状的，但不会破裂。事实上，Pilsczek及其同事的一项电子显微镜研究发现，囊泡中含有少量物质，使人联想起DNA链，核小体存在于S. aureus刺激的中性粒细胞胞浆中。他们提出，这些囊泡是通过外核膜（ONM）出芽形成的，然后在质膜上被胞吐，在NET释放过程中保持核膜和质膜完整。然而，目前尚不清楚含有DNA的囊泡如何在不破坏核膜或形成双膜囊泡的情况下从ONM形成。用离子霉素刺激的人、小鼠和HL60衍生的中性粒细胞的内部和ONMs的高分辨率活细胞成像显示，核膜不会因囊泡化而解体，而是在多个点断裂，染色质从这些点释放到细胞质中（图1和图2）。 INMs和ONMs的破裂发生在核纤层蛋白不连续性出现后一分钟内，未观察到随后的核膜重新密封。然而，这些研究是在离体细胞上进行的，在生理环境下DNA是如何从细胞核释放出来的还有待确定。 1. 核包膜如何在核分裂期间破裂？ 如前所述，在有丝分裂过程中，或在严格限制下的细胞迁移过程中，MT马达产生的力或在细胞外环境中产生的力可导致核膜破裂。相反，在中性粒细胞中，在没有细胞限制的情况下，细胞骨架完全解体后，核膜破裂。因此，在NETosis期间必须有替代机制来驱动核膜破裂。PAD4缺乏可损害核膜破裂。染色质解聚和核膜破裂对PAD4的依赖性表明破裂可能由解聚驱动。染色质解聚产生的熵压或渗透压是否足以使核膜破裂仍有待确定。 2. Gasdermin D介导的核膜通透性 Gasdermin D是一种成孔蛋白，可被半胱天冬酶1、4、5和11（在小鼠中）切割以释放N-末端结构域（Gasdermin N），该结构域可插入膜中并通过寡聚形成20 nm的孔。Gasdermin D被认为在细胞溶质LPS诱导的NETosis过程中被caspase 11切割，在PMA诱导的NETosis过程中被中性粒细胞弹性蛋白酶切割。在这两种刺激下，来自gasdermin D–null小鼠的中性粒细胞未能将其DNA挤出到细胞质中，这表明核膜破裂存在缺陷。在DNA释放到细胞质之前，通过活体成像观察核膜通透性。 因此，人们很容易推测，在NETosis期间，gasdermin D裂解介导核膜通透性，使蛋白酶能够接触组蛋白并促进随后的染色质解聚。Gasdermin D优先插入磷酸化磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸阳性膜。虽然这些脂质在核膜上有报道，但它们是否存在于INM或ONM中，或两者都存在，尚不清楚。因此，在核发育过程中是否以及如何在核膜上形成gasdermin D孔需要进一步研究。 3. 开放性问题：DNA如何释放到细胞质中 尽管人们普遍认为，要发生核变性，去浓缩的染色质必须破坏核纤层蛋白网状结构和核膜，但对这一过程中涉及的机制知之甚少。在NETosis过程中，是什么介导了核纤层蛋白不连续性的出现？如果它们是局部分解的结果，那么在NETosis期间，哪些酶介导核纤层蛋白网状结构分解所必需的翻译后修饰？染色质降解产生的机械力能介导核纤层蛋白网状结构和核膜的破裂吗？在NETosis期间，INMs和ONMs以及核纤层蛋白网络的动力学是什么？如果解聚的染色质被包裹在从核膜发出的小泡中，这些小泡的结构是什么？如果这些囊泡同时包含INM和ONM，它们将如何与质膜的单一膜融合？对正在经历 NETosis 关键步骤的细胞进行高分辨率实时成像，是了解此过程中 DNA 释放的机制的重要方法。 NE Tosis期间细胞骨架和膜细胞器的重塑 一旦解聚的染色质从细胞核释放到细胞质溶胶中，它必须在到达质膜之前打破细胞骨架和膜细胞器的拥挤和相互连接的网络。细胞骨架和膜细胞器在溶解性坏死期间经历剧烈的重塑（图1和图2）。事实上，肌动蛋白丝、MTs和波形蛋白中间丝在细胞外DNA释放前分解。类似地，内质网被证明具有囊泡作用，颗粒被认为会解体，线粒体可能释放其DNA。 有丝分裂是另一个细胞过程，在此过程中，细胞骨架和膜细胞器发生类似的剧烈重塑。有丝分裂纺锤体的形成首先需要拆除先前存在的间期MT阵列。同样，间期肌动蛋白和波形蛋白中间丝网络的重塑对于中期硬皮质的形成至关重要。高尔基体囊泡形成和线粒体分裂在有丝分裂期间确保这些细胞器在子细胞中的均匀分布。因此，除了核膜破裂外，细胞骨架和膜细胞器的解体是有丝分裂和网状分裂之间的一个常见步骤，尽管后者中这些结构不会发生改变。 1 NETosis中的细胞骨架解体 细胞的三个细胞骨架系统形成一个紧密、相互连接的网络，赋予并维持细胞的物理完整性。僵硬的MT网络调节整个细胞膜细胞器的运输和分布，皮质的动态肌动蛋白细胞骨架设定质膜张力并驱动细胞形状变化，密集的中间丝网络允许细胞抵抗大变形。有趣的是，所有这些细胞骨架网络在NETosis期间迅速解体。 1. 肌动蛋白分解 在三种细胞骨架网络中，肌动蛋白细胞骨架在NETosis过程中的研究最多。在C. albicans引起的NETosis中肌动蛋白被降解。然而，在PMA、离子霉素和LPS诱导的NETosis中，已报道缺乏荧光鬼笔环肽染色以及单体和丝状肌动蛋白探针的增溶，这表明肌动蛋白细胞骨架通过丝状解聚而不是降解来分解。肌动蛋白细胞骨架的解体是PMA、离子霉素和LPS诱导的NETosis中最早的事件之一，发生在NETosis刺激后几分钟内。更重要的是，使用jasplakinolide稳定肌动蛋白细胞骨架会损害NETs的形成。然而，PMA刺激后早期添加肌动蛋白丝解聚药物也会损害NETosis，这表明动态肌动蛋白网络对NETosis的发病很重要，并且肌动蛋白丝解聚受到时间调节。 肌动蛋白在NETosis过程中分解的可能机制 由于肌动蛋白的分解是高效NETosis所必需的，因此了解这一机制很重要。肌动蛋白解聚因子包括肌球蛋白II和胶溶蛋白对钙敏感。因此，细胞内钙内流可能是肌动蛋白分解的主要驱动因素。肌动蛋白MICAL家族的蛋白质氧化，驱动纤维的解体并阻止其重新聚合。考虑到ROS在NETosis开始时迅速增加，并且氧化肌动蛋白在钙离子载体诱导的NETosis中以高水平存在，MICAL也是调解NETosis期间肌动蛋白分解的良好候选。由于肌动蛋白丝的分解是快速和全局性的，它很可能是由多种肌动蛋白分解因素的组合效应引起的。 肌动蛋白分解在NETosis中的可能作用 肌动蛋白细胞骨架的解体是如何导致NETosis的？肌动蛋白降解被认为是介导中性粒细胞弹性蛋白酶向细胞核移位的途径。然而，这一概念还没有通过破坏肌动蛋白降解进行试验，而且肌动蛋白在调节核输入中的作用尚未确定。jasplakinolide处理的中性粒细胞的活细胞成像显示，肌动蛋白丝的稳定会损害细胞外DNA的释放，而不会影响DNA从细胞核释放到细胞质中。此外，在有jasplakinolide存在的情况下确实发生NETosis的情况下，解聚的染色质通过肌动蛋白皮质的孔局部释放。这些数据表明，皮质肌动蛋白丝网络是质膜破裂和DNA释放到细胞外环境的物理障碍，肌动蛋白细胞骨架的早期分解可消除这种障碍。肌动蛋白丝解体是否通过改变细胞膜成分和/或降低所需的质膜破裂力来促进质膜破裂值得研究。 2. 微管和波形蛋白中间丝解体 除了肌动蛋白解聚外，NETosis还伴随着聚合MTs和波形蛋白中间丝的急剧减少。在实时成像过程中，α-和β-微管蛋白免疫染色的减少以及MT标记物的快速溶解反映出，经历NETosis的中性粒细胞分解了它们的MT网络。同样，通过波形蛋白免疫染色的减少和波形蛋白增强型绿色荧光蛋白（eGFP）在活细胞中的增溶，波形蛋白中间丝网络在NETosis期间被重塑。有趣的是，免疫染色显示外周波形蛋白的分解比核周丝更多，这意味着在NETosis期间波形蛋白的分解可能是一个受调节的过程。 NETosis过程中微管解体的可能机制和作用 目前的数据表明，从药理学角度来看，分解或稳定MT不会损害NETosis，这表明NETosis不需要完整的MT网络或其分解。然而，MTs的迅速和戏剧性的丧失仍然是有趣的。众所周知，MTs是钙不稳定的，并且已经证明在钙浓度为1~4μM的细胞中可以分解。活化的中性粒细胞中的细胞内钙浓度在微摩尔范围内。因此，中性粒细胞内的钙浓度可能足以诱导MT分解。NETosis中MT分解的机制以及微管调节蛋白的可能作用有待进一步研究。 波形蛋白重塑在NETosis中的可能机制和作用 与肌动蛋白丝的解体类似，波形蛋白网络的缺失可以为染色质介导其更有效地从细胞释放扫清道路，这使得波形蛋白重塑的机制备受关注。PAD4缺乏延迟了NETosis期间的波形蛋白重塑，表明这一过程涉及PAD4功能。此外，在离子霉素和nigericin刺激下，波形蛋白缺失小鼠的中性粒细胞释放更少的NET。有趣的是，波形蛋白在NETosis期间被瓜氨酸化，而钙离子载体刺激的巨噬细胞中的波形蛋白瓜氨酸化被认为会诱导波形蛋白在细胞核周围重新分布。 因此，瓜氨酸化可诱导NETosis期间波形蛋白重塑。瓜氨酸化波形蛋白存在于类风湿性关节炎（RA）患者的滑液中，参与RA的发病机制。此外，抗瓜氨酸化波形蛋白的抗体可诱发NETosis，这表明瓜氨酸化波形蛋白可能导致NETosis的有害影响。然而，与肌动蛋白细胞骨架类似，调节波形蛋白中间丝的分解或降解的激酶和蛋白酶也对细胞内钙敏感，提示PAD4的另一种机制。还需要进一步的研究来破译瓜氨酸化和钙在NETosis期间波形蛋白分解中的作用。 3. 开放性问题：细胞骨架解体 除了对细胞结构完整性的要求外，细胞骨架对信号传导至关重要，包括机械传导、细胞极性、细胞器的运输以及力的产生。因此，细胞骨架解体的程度引起了几个问题：正在进行细胞分裂的细胞的质膜是极化的吗？在NETosis期间，细胞器是如何定位的？完成任务所需的力是如何产生的？在细胞必须整合ECM刚度和拓扑结构的生理环境中，NETosis将如何进行？力量产生的替代思维和物理模型对于理解在体内如何发生NETosis至关重要。 2 膜细胞器 细胞质中不仅充满了细胞骨架，还包括颗粒、内质网、高尔基体、内体、溶酶体、线粒体和核糖体等细胞器。尽管许多细胞器系统在NETosis过程中未被彻底检查，但有证据表明，内质网、颗粒和线粒体在NETosis过程中发生了重大变化。 1. 内质网囊泡形成和颗粒解体 在离子霉素和LPS刺激下，内质网在细胞骨架解体后几分钟内出现囊泡。有趣的是，内质网囊泡形成比核膜破裂早得多，表明这两种细胞器之间失去了连续性。钙离子载体是内质网囊泡形成的诱导因子，提示NETosis时细胞内钙的增加可能介导内质网囊泡形成。 中性粒细胞颗粒驻留蛋白，包括中性粒细胞弹性蛋白酶、MPO、PR3、组织蛋白酶G和乳铁蛋白，这些都在NETs上发现。虽然中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G从初级颗粒释放时没有颗粒溶解，但MPO、PR3或乳铁蛋白定位到NETs的机制尚不清楚。有趣的是，虽然MPO在NETs释放之前在DNA上显示出弥散的细胞内定位，但据报道乳铁蛋白定位于质膜，这表明在NETs释放期间特定的颗粒成分可能针对特定的细胞隔室。中性粒细胞颗粒是否在NETosis过程中变得通透性或破裂，以允许颗粒驻留在NETs上的蛋白质释放，有待进一步研究。 2. 线粒体在NETosis中的作用 线粒体在NETosis中起两种作用。首先，线粒体可以介导活性氧的产生，其次，线粒体DNA（mtDNA）可以在细胞外释放。研究表明，钙离子载体或核糖核蛋白-免疫复合物（RNP-IC）诱导的系统性红斑狼疮（SLE）患者的NETosis以及低密度粒细胞自发NETosis需要线粒体活性氧生成的增加。因此，除了NADPH氧化酶外，线粒体在NETosis过程中还可以释放ROS。 几项研究表明，线粒体DNA可以在细胞外释放，并且可以与细胞核DNA在网络上结合。然而，潜在的机制仍不清楚。在RNP-IC诱导的NETosis过程中，线粒体定位于质膜，在质膜上释放氧化的线粒体DNA。然而，线粒体有两层膜，所以，这个细胞器是如何和质膜的单膜融合并释放DNA的还不清楚。线粒体DNA首先是通过线粒体断裂释放到细胞质中的吗？线粒体和质膜融合吗？这些问题仍然需要通过仔细分析线粒体膜和DNA动力学来回答。 细胞外DNA释放：突破质膜 NETs经常被观察为细胞外DNA，这一发现表明DNA进入细胞外环境。要使DNA释放到细胞外，去浓缩的染色质必须突破质膜。除了重要的NETosis，在这期间，解聚的DNA被认为是通过胞吐作用释放到细胞外的，目前的大多数证据表明，溶解性NETosis期间释放的细胞外DNA发生在质膜溶解之后。然而，在重要或溶解性NETosis中，质膜变化的机制仍不清楚。最近的证据表明，质膜破裂可能是一个多步骤的过程，在此过程中，质膜的通透性在破裂和细胞外DNA释放之前增加（图1和图2）。 1 质膜通透性增加 在NETosis期间，随着时间的推移，质膜在刺激后变得对越来越大的分子具有渗透性，但仍保留含有染色质的能力，染色质从破裂的细胞核扩展到细胞质中。质膜首先被钙黄绿素渗透，然后是10-kDa右旋糖酐，最后是70-kDa右旋糖酐，然后出现一个大洞并在细胞外释放DNA。在细胞对小分子（钙黄绿素）具有渗透性后，质膜逐渐渗透，而没有剧烈的细胞肿胀或快速破裂，这表明随着时间的推移，可能会形成和/或封闭几类不同孔径的膜孔。 中性粒细胞表达几种类型的成孔蛋白，其中，gasdermin D与NETosis有关。NETosis过程中的质膜通透性是由gasdermin D介导的吗？gasdermin D的N端结构域已被证明可形成直径约20 nm的孔。由于钙黄绿素（0.6 kDa）和右旋糖酐（10 kDa和70 kDa）的流体动力学半径分别小于1 nm、1.9 nm和6.8 nm，因此它们能够一次通过20 nm gasdermin D孔，而不是逐步进入。因此，gasdermin D孔可能仅在质膜通透性的后期形成。细菌毒素，如金黄色葡萄球菌，已被证明能破坏细胞膜的通透性。然而，在没有毒素的情况下，观察到在NETosis期间进行性的血浆膜通透性，排除了毒素的需要。因此，如何以及为什么质膜通透性在NETosis期间逐渐增加有待进一步研究。 2 染色质肿胀引起的质膜破裂 用质膜染料染色或表达荧光质膜标记物的中性粒细胞活细胞成像显示，细胞外DNA的释放发生在质膜破裂的局部部位。重要的是，这种膜破裂发生在渗透性逐渐增加数分钟到数小时后，这表明它不仅仅是细胞肿胀和破裂的结果。NETosis时质膜破裂的分子机制尚待揭示。 Neubert及其同事提出了NETosis中质膜破裂的生物物理机制。他们表明，在NETosis结束时，细胞外DNA释放是一个被动过程，不依赖于糖酵解、ATP、代谢和MPO。他们估计完全解离的基因组DNA产生的熵压为100–200 Pa，NETosis结束时的膜压约为20 Pa，他们提出染色质膨胀可能会机械地破坏质膜。这一概念为理解NETosis的生物物理学带来了新的视角；然而，它受到其他现有数据的挑战。例如，如果染色质肿胀是一个不足以导致质膜破裂的返回点，为什么有些细胞仅在胞质溶胶中释放其DNA，而在诱导NETosis数小时后仍不能释放细胞外DNA？因此，需要进行进一步的研究，以了解NETosis期间质膜破裂的分子和物理机制。 总结 NETosis领域正处于一个激动人心的阶段，在这个阶段，NET释放的病理生理相关性的证据已经积累，但驱动这一过程的分子、细胞和生物物理机制才刚刚开始被揭示。目前的大多数文献都集中在哪些刺激可以诱导NETosis，哪些蛋白质可以抑制NET的释放，而对这些因素如何影响NETosis的细胞事件没有明确的认识。当NETosis通过一系列特定的事件（图1和图2）进行时， 确定抑制NETosis的蛋白质如何干扰该序列将有助于我们理解NETosis的基本机制，并告知我们在疾病中调节NETosis的新靶点。此外，研究这一不寻常的细胞过程可以深入了解其他细胞机制，包括转录的染色质失活，以及核纤层蛋白综合征。在本综述中提出的所有问题中，有几个可能值得特别注意，以进一步加深我们对NETosis细胞生物学和生物物理学的理解。 1.NETosis是如何引发的？ 2.与其他形式的宿主防御相比，是什么让中性粒细胞经历了NETosis？ 3.细胞骨架和细胞器重塑的机制和作用是什么？ 4.如何产生NETosis所需的力？ 5.重要NETosis的机制是什么？ 6.中性粒细胞如何在接受NETosis时整合体内环境的分子和物理复杂性？ 这篇综述不仅仅是总结了目前对于NETosis发生发展的细胞机制，更是提出了一些目前尚未彻底解决的问题，这可能对于后续的研究有一定的借鉴意义和价值。   8个月，88亿！真把医保当提款机了？！  多少人在假装搞科研？连一篇基础3分都发不出？  |
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