胶质瘤分子标记物丨MGMT

明醫 2021-10-24

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烷化剂是自然界中普遍存在的重要诱变剂和致癌物质，主要通过形成O⁶-甲基鸟嘌呤（O6-mG）造成对细胞DNA碱基的烷基化损伤发挥致癌、细胞毒和骨髓抑制等作用。2000年Esteller等发现O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine Methyltransferase，MGMT)基因与烷化剂化疗的敏感性相关，随后研究证实MGMT是一种可以编码修复O⁶-甲基鸟嘌呤的酶，定位于10q26，它能够保护肿瘤细胞染色体免受烷化剂的细胞毒作用。和多数管家基因相似，MGMT基因的启动子也少TATA 盒和CAAT盒，且在其转录起始区域富含GC序列。MGMT启动子中CpG岛的过度甲基化会降低基因的表达，从而导致基因沉默和抑制蛋白合成，阻碍DNA的修复。研究者们发现具有MGMT启动子甲基化的胶质瘤患者对化疗、放疗更敏感，且肿瘤患者生存期较长。

MGMT是DNA修复蛋白，可逆转由烷化剂引起的DNA损伤。其修复 DNA的机制是通过自身活性中心的半胱氨酸残基(cys145)与O6-烷基－鸟嘌呤(O6-AG)上的烷基团共价结合并将后者移除。DNA甲基转移酶介导MGMT启动子CpG岛甲基化，可降低肿瘤细胞中MGMT的活性。当MGMT启动子甲基化时，MGMT失活，DNA修复受阻。这一改变有助于替莫唑胺类烷化剂发挥治疗效果。一些胶质瘤中存在MGMT启动子高甲基化。因此，MGMT启动子甲基化状态已成为胶质瘤患者是否适合烷化剂化疗的重要分子指标之一。

MGMT启动子包括含97个CG二核苷酸(CpG位点)的CpG岛。在正常组织中，MGMT的CpG位点一般都处在非甲基化状态。MGMT的CpG位点甲基化会导致染色体结构改变，从而阻止转录因子结合、导致MGMT基因的沉默。MGMT主要分布于细胞质，DNA损伤后才转移到细胞核。在细胞核中，MGMT可以使烷化剂作用下形成的O⁶-甲基鸟嘌呤去甲基化，有效地修复DNA损伤，同时自身不可逆失活为烷基化MGMT。MGMT一个分子只能修复一个烷基加合物，因此，MGMT被称为自杀酶。细胞的修复能力取决于MGMT在细胞内的含量和合成速率，而MGMT基因启动子甲基化可以导致基因沉默和抑制蛋白合成，阻碍DNA的修复。MGMT启动子甲基化在少突胶质细胞瘤中发生率为60%～80%，在少突-星形细胞瘤发生率为60%～70%，在GBM发生率为20%～45%，在间变性星形细胞瘤发生率为40%～50%，在毛细胞型星形细胞瘤发生率为20%～30%。在继发性GBM和低级别弥漫性胶质瘤中，MGMT启动子甲基化状态与IDH基因突变和1p/19q缺失的状态呈正相关。复发胶质瘤样本中MGMT启动子甲基化水平较第一次手术样本多有明显的增加，但胶质瘤患者的中位生存期只受初治胶质瘤中MGMT启动子甲基化状态的影响。MGMT启动子甲基化与胶质瘤对于烷化剂化疗的敏感性之间有密切关系。Hegi等报道，接受放疗和替莫唑胺治疗的患者，MGMT启动子甲基化者具有更长的生存期。MGMT状态可提供预后信息，并对治疗选择有指导意义。通过甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测MGMT启动子甲基化，不仅应用于实验研究，而且被列为临床常规诊断项目。

MGMT基因启动子甲基化检测至关重要，然而MGMT基因未发生甲基化时，其编码的MGMT蛋白容易受糖皮质激素、电离辐射、有毒试剂等诱导而表达异常，所以采用病理标本免疫组化检测MGMT蛋白的活性并非十分可靠，而检测MGMT基因的甲基化可能会更特异、更敏感。目前的MGMT甲基化检测方法大多是基于亚硫酸氢盐修饰的定性检测方法，例如甲基化特异性PCR（MS-PCR）、联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法（COBRA）、荧光定量法（Methylight）、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-HRM）、亚硫酸氢盐处理后测序等。其中MS-PCR与MS-HRM最为常见，MS-PCR在亚硫酸氢盐处理后，根据预先知道待测片段的DNA序列设计两对引物（甲基化引物为M-f和M-r，未甲基化引物为U-f和U-r），并进行扩增。如果甲基化引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，而未甲基化引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。这种方法的优点是不需要特殊仪器，经济、便利、灵敏度较高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。缺点是要先明确待测DNA序列，才能设计出好的引物，且若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况则可能出现假阳性结果。

MS-HRM是一种高灵敏度、高重复性的甲基化检测方法，是根据已知甲基化程度的标准曲线对样品的甲基化百分比进行测定的方法。由于甲基化DNA含有更多的GC，且相对更难熔解。亚硫酸氢盐处理后，甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异，此时通过熔解曲线分析样品的熔解温度及峰型，可轻易区分完全甲基化、完全未甲基化或杂合甲基化。MS-HRM进行甲基化分析仅需一对引物，相比以往的方法更加快捷、简便和精确。不过对仪器有一定的要求，必须拥有带HRM模块的荧光定量PCR仪。

MGMT甲基化可采用基因芯片分析。首先将基因组DNA分成两份，一份用来做MeDIP，另一份作为对照。两个样品都标记荧光（富集的样品用Cy5标记，对照用Cy3标记），然后与芯片杂交。芯片上每个探针的Cy5/Cy3强度比例显示出该区域的甲基化程度。随着第三代测序技术的出现，Chin等在Nature Methods阐明单分子实时（SMRT）测序技术甚至能够直接测定DNA的甲基化。该方法通过对DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链的过程（荧光脉冲的到达时间和持续时间）进行实时监测，直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。