【原】转录组代谢组蛋白质组解密如何延长寿命

健明 2021-10-26

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我前面的教程：转录和蛋白水平的表达量相关性如何，解读了一个很有意思的文献，它包含着转录组数据，蛋白质组和代谢组，而且数据是可以下载进行图表复现。恰好有学徒进行到了蛋白质组研究，还在抱怨我们《生信技能树》平台的相关教程太少了，我就趁机邀请她来做这方面知识整理，先从文献解读开始！

下面文献解读

摘要

年龄的增长会导致生理机能的退化以及紊乱的能量平衡。NAD+依赖的SIRT6脱酰基酶可以通过一些未知的机制调控衰老和代谢。本研究暂时了SIRT6过表达会导致雌性和雄性小鼠中的虚弱减弱，并延长了生命周期。结合生理实验，体外多组学分析以及^13^C乳酸追踪表明野生型小鼠中的葡萄糖稳态和肝脏葡萄糖的输出随着年龄的增长而下降。相反地，年长的SIRT6转基因小鼠能够通过使用两种主要的葡萄糖异生作用的前体物质（乳糖和甘油）来保留较高的葡萄糖输出以及葡萄糖平衡。为了调控这些变化，从机制上来说，SIRT6能够增加较高的葡萄糖异生基因的表达，体内的NAD+合成以及系统地增强从脂肪组织中释放甘油。这些发现表明SIRT6能够优化年老者体内陆能量平衡，从而延缓衰弱阻止健康衰弱。

背景介绍

SIRT6能够以HIF1-a依赖的行为抑制糖酵解，因此可以通过抑制Warburg效应来发挥抑制癌症因子的作用
Warburg effect：正常分化的细胞主要依靠线粒体的氧化磷酸化为细胞供能，而大多数肿瘤细胞则依赖有氧糖酵解，这种现象被称为“Warburg effect”。有氧糖酵解产生的ATP效率很低，但是却赋予了肿瘤细胞很多优势。

结果

SIRT6而不是SIRT1调控两种性别的C57BL/6JOlaHsd小鼠的生命周期

在C57BL小鼠中，SIRT6过表达导致雄性和雌性的中位寿命分别延长了27%和15% (p = 7.1 × 10^−6^和1.1 × 10^−6^)，而SIRT1过表达对生命周期延长的影响不是很显著。

SIRT6能够延长衰老的小鼠的健康期

在25个月大时，SIRT1 + 6-tg小鼠的肿瘤明显减少。在自然死亡时，没有观察到肿瘤发生率的差异，这表明SIRT1+6-tg（SIRT1和SIRT6过表达的小鼠）小鼠在生命中发生肿瘤的时期较晚，但是最终以相似的肿瘤负荷死亡。在SIRT6-tg（SIRT6过表达）的小鼠中也观察到类似的趋势。自然死亡时，不同的表型之间癌症的发生率时类似的，但是在25月龄的SIRT6和SIRT1+6过表达的小鼠中，也没有显著降低。在25月龄和自然死亡时，SIRT6和SIRT1+6敲除的小鼠的肠道腺瘤患病率显著降低。

与衰老的小鼠相比，年轻小鼠表现出更高的代谢灵活性，通过呼吸交换比（Respiratory exchange ratio，RER）测量，可以看出从碳水化合物到脂肪酸的昼夜能量来源转换。有趣的是，年老的SIRT6过表达的小鼠与年轻的小鼠有相似的震荡的RER模式。
雄性小鼠中，SIRT6的过度表达抑制了年龄相关的体力活动的下降。与15个月的同窝鼠相比，SIRT6过表达和SIRT1和SIRT6过表达的雄性小鼠的运动距离明显更长。

SIRT6能够影响断食过程中GNG以及三羧酸（TCA）循环相关的血清代谢物

禁食增加了循环中的游离脂肪酸(FFAs)和β-羟基丁酸盐的水平，可能是由于激活了脂肪分解和生酮。相反，包括支链氨基酸(BCAAs)异亮氨酸和缬氨酸在内的多种循环氨基酸在禁食时减少，可能是由于饮食中AAs的减少。在禁食期间，SIRT1、SIRT6或两者都过表达的小鼠中，这些BCAAs的水平显著降低。WT小鼠在禁食4至16小时后血糖水平下降。有趣的是，不是SIRT1而是SIRT6过表达抑制了这种反应。类似的现象在GNG，TCA循环中也观察到了。

SIRT6阻止年龄相关的血糖水平和GNG能力的恶化

在禁食期间，年老的SIRT6-tg小鼠的葡萄糖水平与年轻的wt小鼠相似（a)
在禁食期间，SIRT6对维持血糖正常的作用并不是性别特异性的，在雌性中也有类似的结果（b）
根据血糖模式，在年老的WT雄性小鼠中，来自这两种前体的糖异生能力显著下降，但在年老的SIRT6-tg雄性小鼠中，糖异生能力维持在与年轻的WT小鼠相似的水平。这种效果与性别无关，因为在女性中也得到了类似的结果（c,d,e,f)

SIRT6促进肝脏分解代谢和抗炎途径

PCA显示，性别是大多数方差(PC1)的原因。此外，在PCA中可以看到显著的基因型效应，其中SIRT6在男性中的作用明显大于女性(a)
通过基因集富集分析(GSEA)，我们发现SIRT6-tg在雄性小鼠中显著抑制了炎症通路，而在雌性小鼠中也有类似但更温和的效果,而且在雄性和雌性SIRT6-tg小鼠中，分解代谢途径的代谢水平均显著上调(b)
SIRT6-tg小鼠体内脂肪酸β-氧化、TCA循环、有氧呼吸和AA分解代谢基因表达显著增加（c）
对雄性和雌性转录组共同的上游调控因子的分析显示，PPARα，一个促进肝脏中脂肪酸β氧化的核受体被激活（d)

年轻化的肝脏TCA循环以及GNG相关的代谢在年老的SIRT6-tg小鼠中分布较广,而且 SIRT6维持NAD+水平，增加NAD+合成基因的从头表达

随着年龄的增长，肝脏葡萄糖丰度降低，SIRT6-tg呈升高趋势(d)
GNG的中间产物葡萄糖-6-磷酸(G6P)和果糖-6-磷酸(F6P)都随年龄增长而增加，但在老年SIRT6-tg小鼠中，它们仍保持在类似年轻的水平(d)
SIRT6过表达抑制了与年龄相关的枸橼酸和顺式乌头酸浓度的下降。（e）
肝脏NAD+和FAD水平随年龄增长而降低。值得注意的是，SIRT6过表达阻止了与年龄相关的NAD+和FAD的下降（f）

SIRT6能够恢复肝脏中与年龄相关的乳酸氧化速率的下降

为了进一步了解年龄依赖性GNG减少的机制，我们使用均匀标记的13C乳酸盐进行了体内稳定同位素示踪（a)
与野生型小鼠相比，以年龄无关的方式给予乳酸后，SIRT6-tg小鼠的肝脏葡萄糖丰度更高(b)
在年轻小鼠中，标记丙酮酸[M + 3]、TCA循环代谢物αKG、琥珀酸和苹果酸[M + 2]、葡萄糖[M + 2, M + 3]的丰度在基因型之间没有发现显著差异(补充图7d)。有趣的是，在老龄WT小鼠中，标记葡萄糖[M + 2到M + 6]的稳态水平，以及最显著的M + 2和M + 3同位素含量显著降低，而老龄SIRT6-tg中仍较高(c)
在WT小鼠中，TCA循环中间体αKG、琥珀酸和苹果酸的标记值随着年龄的增长而显著降低，但在SIRT6-tg小鼠中仍然较高(d)
在肝脏中，当有过量的乳酸或在GNG诱导下，乳酸脱氢酶(LDH)催化NAD+依赖的乳酸可逆转化为丙酮酸。随着年龄的增长，[U-13C]-乳酸注射后总丙酮酸和丙酮酸M + 3水平显著降低(e)
年老的SIRT6-tg小鼠中乳酸脱氢酶(LDH)的丙酮酸产量更高，可能是由于较高的NAD+水平(f)
有趣的是，与乳酸相比，丙酮酸的GNG容量在基因型之间没有差异（h）

SIRT6能够通过增加脂肪中的脂肪分解促进肝脏中的葡萄糖异生作用

在注射乳酸后，肝脏特异性SIRT6-tg和对照组小鼠在年轻和年老时血糖水平相似（a）
肝脏转基因与对照组小鼠的关键肝脏GNG基因表达水平相似，肝脏GNG相关代谢物表达水平相似，甚至有所降低（b）
在WT小鼠中，GNG前体乳酸和丙酮酸的循环水平随着年龄的增长而下降，但在SIRT6过表达小鼠中没有（c）
脂肪组织中关键脂解酶、激素敏感脂肪酶(HSL)的活性磷酸化形式在老年SIRT6-tg小鼠中增加（d）

讨论

为了解释SIRT6如何在生化和分子水平上促进健康寿命，以及有多少组织必须过度表达SIRT6才能改善健康这些问题，该研究追踪了在近交系C57BL/6JOlaHsd小鼠中SIRT6过表达的影响。

结果发现：
表达SIRT6而非SIRT1的C57BL/6JOlaHsd雄性和雌性小鼠的寿命明显长于野生同窝鼠。SIRT6-tg小鼠保持了类似年轻的身体活动和代谢灵活性，并减少了与衰老相关的疾病。老年SIRT6-tg小鼠表现出一种类似年轻小鼠的肝脏代谢物图谱。值得注意的是，SIRT6能够在有限的能量条件下(如禁食和衰老)产生能量。为了调节这一功能，SIRT6促进肝脏β-氧化、乳酸和甘油穿梭和肝脏利用、肝脏中NAD+/NADH比值以及脂肪组织中甘油的释放。这些SIRT6调控的代谢途径协同维持老年期类似年轻的TCA周期和GNG活动。SIRT6对健康寿命的积极作用是菌株和性别无关的，需要SIRT6调节至少两个部位的能量生产，肝脏和脂肪组织。
总的来说，SIRT6控制着寿命和在有限的可用时间(如体育活动、禁食和衰老)产生能量的能力。这些信号通路，以及SIRT6在衰老相关的关键代谢信号通路mTOR、IGF-1和AMPK中已知的调节作用，使SIRT6成为健康衰老的主要调节因子，并作为一个潜在的治疗靶点，以保持功能和延缓衰弱的发生。

方法

这里我们主要关注的是蛋白质组学的方法，其他方法感兴趣的可以看原文

肝脏蛋白质组

LC-MS分析的样品制备

采用标准的甲醇/氯仿萃取方案(样品:甲醇:氯仿:水::1:4:1:3)，对6例对照和6例小鼠组织裂解液进行300 μg沉淀，以去除脂质和洗涤剂82。蛋白在30 μl浓缩尿素缓冲液(8 M尿素、2 M硫脲、150 mM NaCl (Sigma))中重悬，用50 mM DTT还原36℃1小时，用100 mM碘乙酰胺在36℃黑暗中烷基化1小时。将浓缩尿素/蛋白混合物用50 mM碳酸氢铵缓冲液稀释12倍，用胰酶/LysC混合物(Promega)在36℃下按1:50 (w/w)酶蛋白比消化18 h。采用Agilent 1260生物惰性高效液相色谱系统和馏分收集器，在10个4.0 mm C18墨盒(Restek, cat# 917450210)上脱盐蛋白质消化液。纯化后的肽被快速真空干燥，并在80℃保存，直到进一步加工。根据制造商说明，用串联质量标签(TMT 6plex, Thermo Fisher)标记肽(100 μg)。每个TMT标记反应包含6个标签，需要在一次MS运行中多路复用。将6种不同TMT标记的多肽组合成一个实验并进行分离。

高pH RPLC分馏和串联策略

采用Agilent 1260生物惰性高效液相色谱系统，3.9 mm 5 mm XBridge BEH Shield RP18 XP VanGuard柱和4.6 mm 250 mm XBridge Peptide BEH C18柱(Waters)进行高ph RPLC分离。溶剂组成为:10mm甲酸铵(pH 10)为流动相A, 10mm甲酸铵与90% ACN (pH 10)为流动相B83。从小鼠肝脏中制备的tmt标记多肽用线性有机梯度(从5%到50% B在80分钟内)分离。最初，每次LC运行每1分钟收集80个馏分。将3个单独的高ph馏分合并为15个主馏分，每个主馏分之间间隔15 min(分数1、16、31、46、61 =主馏分1，分数2、17、32、47、62 =主馏分2，以此类推)。组合馏分被快速真空干燥，脱盐，并在80℃保存，直到最终的LC-MS/MS分析。

纳米质/ MS分析

使用UltiMate 3000纳米LC系统与Q Exactive HF质谱仪(Thermo Scientific, San Jose, CA)耦合分析纯化的肽组分。每个馏分在35 cm毛细管柱(3 μm C18 silica, Hamilton, HxSil cat# 79139)上分离，色谱柱ID为150 μm，线性有机梯度，流速为550 nl/min。流动相A和B分别由0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈组成。用Q - Exactive HF质谱仪在毛细管加热温度+280℃，喷雾电压2.5 kV下获得串联质谱。完整的MS1光谱在300 ~ 1500 m/z范围内获得，分辨率为12万，最大积累时间为50 ms，自动增益控制(AGC)设置为3 106。采用固定第一质量为100 m/z的动态m/z范围获得了Dd-MS2光谱。MS/MS光谱分辨率为30000，最大积累时间为155 MS, AGC目标设置为2 105。选取12个最丰富的离子进行破碎，使用30%的标准化高碰撞能量。用40秒的动态排除时间对先前分析的离子进行鉴别。

生物信息分析

LC-MS分析的原始文件使用MSConvert软件(ProteoWizard 3.0.6002)转换为mascot generic format (.mgf)，使用Mascot2.4.1和X!Tandem CYCLONE (2010.12.01.1) 针对Uniprot数据库中的SwissProt小鼠序列(2016年版本，添加了115个已知的污染物蛋白)。以TMT6plex赖氨酸和n端作为氨基甲基半胱氨酸固定修饰和可变修饰、天门冬酰胺和谷氨酸脱酰胺、赖氨酸和n端氨基酰化和氧化蛋氨酸的搜索参数。肽质量耐量分别为20ppm和0.08 Da，前体和片段离子允许有两个缺失的裂解，与仪器质量精度一致。Mascot2.4.1和X!Tandem CYCLONE Scaffold Q + 4.4.6 (Proteome Software, Inc)对串联搜索引擎结果进行分析。采用PeptideProphet和ProteinProphet概率模型计算多肽和蛋白概率。TMT通道同位素纯度也根据TMT试剂盒说明进行校正。
蛋白结果以蛋白和肽FDR 1%为阈值过滤，需要至少一个独特的肽段（unique peptide）进行蛋白鉴定。那些从单一肽中识别的蛋白质，如果该识别被多个搜索引擎(如前所述)确认并在所有样本中识别，则被包括在进一步分析中。从Scaffold中提取报告离子强度定量值，去除诱饵光谱、污染光谱、多个蛋白共享的肽谱和缺失通道强度的肽谱(总体<2%缺少量化信号)。然后，通过对所有通道中属于一个蛋白质的所有报告离子强度的中位数减去，将log2转换后的相对丰度归一化。相对蛋白质丰度是由蛋白质组合中所有肽的中位数来估计的。来自样品制备的蛋白质样品加载效应通过中值抛光校正，即从所有通道的相对丰度估计中减去通道中值，得到中值0。如果被定量到的蛋白质有共同的肽段，则将它们聚在一起，并将相应的基因名称分配给每个蛋白质以简化数据表示。从两次TMT实验中得到的每个蛋白都被拟合到线性模型和经验贝叶斯方法来评估组间的差异表达。蛋白质显著性(p值)通过普通t检验和中等t检验计算。调节t统计量是蛋白的log2表达量与其标准误差的比值。计算各样本组的对数倍表达变化及p-value <0.05为显著差异。通过人工筛选和结合Uniprot、GO和KEGG数据库信息进行蛋白注释。使用R编程语言(3.4.0)和Bioconductor上的免费库对数据进行进一步的生物信息学分析和可视化。
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MS蛋白质组学数据已通过PRIDE90合作伙伴存储库存储到ProteomeXchange联盟，数据集ID为PXD021447