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这两年，随着外泌体研究的火热，miRNA的研究又变得多样化，而研究miRNA最基本的，莫过于设计miRNA的引物啦。今天我给大家介绍最常用的茎环法设计引物。 miRNA引物设计（茎环法）原理：由于miRNA在23bp左右，没法根据其设计引物检测出来，于是，我们可以将其延长，也就是先加一个环状片段，这样就使得原来23bp左右的延伸为80bp左右了，然后就可以根据这个80bp片段设计引物啦。 具体操作：逆转录反向引物以has-miR-145为例设计引物，其成熟体序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU。每个反向引物都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环。固定序列为： 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3’。 在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是has-miR-145从后面数八个碱基的反向互补序列，就是GAAUCCCU的反向互补：AGGGATTC,最后得到的反向引物的序列为： 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGGGATTC-3’ PCR引物：正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定序列为： ACACTCCAGCTGGG 在这个序列后加上成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除后面六个碱基序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGA，把U变成T即可，最后的序列为：5’-ACACTCCAGCTGGG GTCCAGTTTTCCCAGGA-3’ 这样我们就得到has-miR-145的正向F引物和反向R引物啦。在做实验时，用R引物将RNA逆转，再用F+R跑PCR就行啦。 当然，直接在茎环上取一段即可设计跑PCR的下游通用引物。如： 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA -3，这个就更简单了，不过本人还是用特异性逆转录引物比较多。 U6的正反向引物分别为 F-CTCGCTTCGGCAGCACA； R-AACGCTTCACGAATTTGCGT。 |
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