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高玉荣，刘立君，李本领，李大鹏 (黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319) 摘要：以发酵香肠、酸菜及酸奶为原料，通过平板分离、体外降胆固醇能力的测定及益生功能评价，筛选出1株胆 固醇降解率为69．2％的益生菌菌株s一59。该菌株不仅具有良好的耐酸能力、耐胆盐能力，而且具有较强的疏水性。 经形态学、生理生化试验，将其鉴定为嗜酸乳杆菌。 随着生活水平的提高及膳食结构的变化，人们 对高脂肪、高胆固醇食物的摄人逐渐增多，导致动 脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病患者的数量不 断增加。因此，研究和利用具有降胆固醇功能的微 生物以降低食品和人体血清中的胆固醇，对改善人 们的健康水平有重要的意义【1]。在认识了降胆固醇对 机体的有益功能后，国内外掀起了降胆固醇益生菌 研究及应用的热潮。这些研究主要集中在降胆固醇 益生菌的筛选和鉴定、降胆固醇机理，以及降胆固 醇微生物制剂和降胆固醇保健食品的开发[2-3]。本文 以酸菜、酸奶等发酵食品为原料，从中筛选具有降 胆固醇功能的益生菌，并对筛选出来的益生菌通过 形态鉴定、生理生化试验及16S rDNA序列分析进行 菌种鉴定。 1 试验材料 1．1分离原料 酸奶、酸菜、发酵香肠，市售。 1．2菌种 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，由黑龙江八一农 垦大学食品学院微生物实验室提供。 2试验方法 2．1乳酸菌的分离 将发酵香肠浸提液、酸菜汁、酸奶进行10倍梯 度稀释，分别吸取l×10。5，1×1酽，1×10。的稀释 液0．1 mL于MRS—CaCO，固体培养基平板上，涂布分 离，于37℃条件下培养24 h。将具有明显溶钙圈的 单菌落挑至MRS固体斜面上，37℃培养24 h。 2．2体外降胆固醇乳酸菌初筛 将分离出的斜面菌种置于MRS液体培养基中， 于37℃条件下培养12。14 h，进行活化。按3％的接 种量接种到含有胆固醇的MRS—CHOL培养基【l】中， 于37℃条件下培养72 h后测定其中的胆固醇含量【4】。 2．3体外降胆固醇乳酸菌的复筛 将初筛获得的胆固醇降解率较高的菌株进行复 筛，将活化的菌悬液按3％的接种量分别接种含有 0．2 mg／mL胆固醇的MRS液体培养基中，于37℃条 件下培养72 h后测定胆固醇含量[41。 2．4体外降胆固醇乳酸菌的益生功能评价 2．4．1 菌种耐酸性能评价 挑取1。2环斜面菌种到10 mL MRS液体培养基 收稿日期：2016—03—03 基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究(面上)项目(12541585)。 作者简介：高玉荣(1970一)，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向为食品微生物与发酵工程。 万方数据 农产品加工 2016年第4期 中，于37℃条件下培养12—14 h。取5 mL菌液以转 速4 000 r／min离心10min，收集菌体，加入10mL经 盐酸(1 m洲L)调节pH值为2．0的生理盐水中，于 37℃条件下培养4 h后，通过平板计数法测细胞存 活率圈。 2．4．2菌种耐胆盐性能评价 挑取1～2环斜面菌种到10 mL MRS液体培养基 中，于37℃条件下培养12～14 h。取5 rnL菌液以转 速4 000 r／min离心10 min，收集菌体，加入10 mL 含0．3％猪胆盐的生理盐水中，于37℃条件下培养 4 h后，通过平板计数法测定细胞存活率翻。 2．4．3菌种疏水性评价 将斜面菌种进行活化，接种到MRS液体培养基 中，于37℃条件下培养14 h后，以转速4 000 r／min 离心10 min，收集菌体细胞，测定菌体细胞的疏 水性。 3结果与分析 3．1发酵食品原料中降胆固醇微生物的筛选 3．1．1乳酸菌的分离 从酸菜、发酵香肠和酸奶中，采用MRS固体培 养基，通过平板分离法分离出120株具有明显溶钙 圈且表面光滑乳白色的单菌落。 3．1．2降胆固醇微生物的初筛 降胆固醇乳酸菌的初筛见表1。 表1降胆固醇乳酸菌的初筛 菌株编号 胆固醇降解率／％ 菌株编号 胆固醇降解率／％ S-12 56．2 C一54 52．9 S—03 58．7 C-23 46．8 S一24 53．9 C-28 53．8 S一15 42．1 C-33 47．3 S-37 54．6 C-52 54．7 S一65 59_3 C-48 41．0 S一21 40．6 C-26 54．1 S一22 45．7 C—41 36．4 S-59 68．9 C一34 65．6 S-61 63．2 C一52 55．1 按照5％的接种量将活化菌株接种到含有胆固醇 的MRS液体培养基中，于37℃条件下培养72 h后， 测定体外降胆固醇的能力，共有18株菌株的降胆固 醇能力大于40％。 3．1．3降胆固醇微生物的复筛 降胆固醇乳酸菌的复筛见表2。 表2降胆固醇乳酸菌的复筛 菌株编号 胆固醇降解率／％ 菌株编号 胆固醇降解率／％ S-59 69．2 C一34 65．4 S一61 63．6 S-65 60．2 对初筛出的18株菌株进行复筛，确定降胆固醇 能力大于60％的菌株4株。 3．2降胆固醇微生物益生功能评价 (1)耐酸性能的测定。 耐酸能力的测定见表3。 表3耐酸能力的测定 由表3可知，4株菌株在酸性环境下存活率大于 30％，其中s一59在pH值为2的酸眭环境下培养4 h 后存活率最高为48．8％。 (2)耐胆盐性能的测定。 耐胆盐能力的测定见表4。 表4耐胆盐能力的测定 由表4可知，4株乳酸菌在胆盐0．3％的生理盐 水中培养4 h后存活率最高的菌株为S一61，存活率 为32．2％；其次是菌株S一59，存活率31．8％，但二 者差异不显著。 (3)疏水性的测定。 疏水性的测定见表5。 表5疏水性的测定 菌株编号 疏水率／％ 菌株编号 疏水率／％ S一59 31．6 C-34 9．46 S一61 28．7 S一65 18．20 由表5可知，菌株s一59和S一61具有较高的疏 水率，分别为31．6％和28．7％；资料报道疏水率介于 20％和50％为中度疏水，因此菌株S一59和S一61细 菌表面的疏水性达到了中度疏水，作为益生菌可以 在肠道黏膜表面黏附并定殖。 由以上益生功能及发酵性能评价结果看出， s一59菌株不仅具有较强的降胆固醇能力，而且有较 强的耐酸、耐胆盐能力和疏水性。因此，对S一59菌 株进行后续研究。 3．3菌种鉴定 3．3．1形态鉴定 (1)个体形态鉴定。 S一59菌株显微形态(10×100)见图1。 由图1可知，S一59菌株的革兰氏染色结果为紫 万方数据 2016年第4期 高玉荣，等：发酵食品中降胆固醇益生菌的筛选及鉴定 图2 S一59菌落形态 由图2可知，S一59菌株的菌落直径为1～2 inin， 呈圆形，表面凸起，微白色，湿润且边缘整齐。 3．3．2生理生化试验 生理生化鉴定结果见表6。 根据《常用细菌系统鉴定手册》，初步将菌株鉴 定为嗜酸乳杆菌。 4结论 (1)以发酵香肠、酸菜及酸奶为原料，通过平 板分离、体外降胆固醇能力的测定获得4株降胆固 表6生理生化鉴定结果 试验项目 结果 试验项目 结果 厌氧生长 + 淀粉水解 + 15℃生长 + 硫化氢 一 pH值4．5 + 甲基红 + 运动 一 明胶 + 葡萄糖 + 产生吲哚试验 一 V—P试验 + 硝酸盐还原试验 一 酪蛋白分解试验 一 果糖试验 + 耐盐性试验 + 鼠李糖试验 一 过氧化氢酶试验 一 乳糖试验 + 蔗糖试验 + 甘露醇试验 + 核糖 + 石蕊牛奶 一 接触酶 一 精氨酸产氨 + 醇能力大于60％的菌株。 (2)通过益生功能评价，筛选出1株胆固醇降 解率为69．2％的益生菌菌株S一59，不仅具有良好的 耐酸能力和耐胆盐能力，而且具有较强的疏水性。 (3)经形态学、生理生化试验，将益生菌菌株 S一59鉴定为嗜酸乳杆菌。 参考文献： [1】 李呢．降胆固醇乳酸菌的筛选及其降解机理研究【D】． 厦门：集美大学，2012． 【2】 王春光，张雪，李达，等．酸菜来源植物乳杆菌的分离 鉴定与耐受性研究叨．食品科技，2010(10)：35—38． 【3】 靳志强，王延祥，李平兰，等．植物乳杆菌耐酸耐胆盐 的体外试验及其降胆固醇作用【J】．中国食品学报， 2009，9(5)：24—28． 【4】 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所．GB厂I' 5009．128--2003，食品中胆固醇的测定[S】．北京：中 国标准出版社，2004． 【5] 杜连群．工业微生物学实验技术【M】．天
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