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1 肺炎球菌、肺炎链球菌与肺炎双球菌是一回事吗 人教版高中生物学旧教材将本实验称为“肺炎双球菌的转化实验”，新教材则标以“肺炎链球菌的转化实验”。实际上,1944年艾弗里发表的文章中采用的名称为“ pneumococcal types”，翻译为“肺炎球菌类型”)，因此，“肺炎双球菌”和“肺炎链球菌”指同一种细菌。目前，在人类医学上多称其为“肺炎链球菌”或“肺炎球菌”2，而在引起动物疾病方面仍存在“肺炎双球菌”的叫法。肺炎双球菌的名称由来是因为肺炎链球菌的菌体呈矛头状、常成双排列。
显微镜下的肺炎球菌↑
2 S型肺炎链球菌的致病机理是什么 在抗生素发明之前，肺炎是导致人类死亡率最高的疾病之一，主要的致病因素就是带荚膜的肺炎链球菌( Pneumococcus)。带荚膜的肺炎链球菌的致病性与其细胞壁上的一层多糖荚膜有关，该多糖荚膜对细菌具有保护作用，可使其逃避人体吞噬细胞的破坏，从而迅速增殖，且引起肺泡组织发生变化，致使人类发病或死亡。带荚膜的肺炎链球菌在培养基上可生长形成表面光滑的菌落，因此被称为S型(Smoh一词字首)。而另一类不致病的R型肺炎链球菌不具备荚膜，可以被机体的免疫系统摧毁，因此不会导致机体发生疾病，在培养基上会形成表面粗糙的菌落，被称为R型( Rough一词字首)。除了表面光滑与粗糙区别之外，S型细菌菌落更大,易与R型菌落区分。3 S型细菌向R型细菌转移的DNA仅仅是荚膜合成相关基因吗 1928年，英国微生物学家格里菲斯错把经过加热的S型菌液当成注射液佐剂，连同未加热的R型菌液混合后注射给小鼠，发现小鼠患败血症死去，并在小鼠体内分离得到S型细菌，证实S型细菌具有使R型细菌转变为S型细菌的转化因子。20世纪40年代，美国微生物学家艾弗里通过一系列实验，结合数学中的“筛法”，依次提取S型细菌无细胞提取液中的蛋白质、脂类、多糖、DNA、RNA等，最后发现将DNA去除后的提取液无法使R型细菌转化成S型细菌，并通过DNA酶(可以降解DNA的酶)处理这种提取液，最终证实了引起细菌转化的因素来自S型细菌的DNA。那么，S型细菌向R型细菌转移的到底是什么DNA?在小鼠体内分离到的S型细菌是什么时候形成的?同高等生物一样，细菌也有遗传性状，如形状颜色、大小、抗性、营养代谢缺陷等，均由细菌的遗传物质包括环状主染色体(称拟核，类染色体)以及游离的环状微小染色体(即质粒，除主染色体之外的染色体)上相应的基因控制。如使S型细菌具有“致病性”这一性状的根本原因是S型细菌中与荚膜形成相关的基因。S型细菌向R型细菌转移的DNA位于哪一种遗传物质上呢?已有研究表明，基本所有类型的肺炎链球菌荚膜多糖合成基因均位于染色体上dexB和aliA基因之间，可以确定S型细菌向R型细菌转移的是其主要染色体上的DNA。那么，S型细菌向R型细菌转移的仅仅是荚膜合成相关基因吗?实际上，在肺炎链球菌的转化过程中，完全的荚膜性状、一系列的中间型荚膜性状、M蛋白性状、青霉素抗性等也得到了转化，而且性状都是独立转化的。因此，肺炎球菌实验中转化的不仅是编码荚膜性状的基因，还包括控制其他性状的基因。结合艾弗里的实验可以确认，当格里菲斯错把经过加热的S型菌液当成注射液佐剂，连同未加热的R型菌液混合后，实际上此时已经完成了DNA的转化，从第4组小鼠体内分离到的S型细菌，就是由R型细菌转化形成的S型细菌。即注射给小鼠的就是新形成的S型细菌，DNA转化发生在注射前而不是小鼠体内。4 S型细菌转移的DNA在R型细菌体内的状态是什么 从S型细菌转移到R型细菌的荚膜合成相关基因及其他基因DNA在R型细菌中是什么样的状态?是整合到R型细菌的主染色体上还是以游离状态存在呢?由于被转移的是位于S型细菌主染色体上的DNA，应是以线性DNA形式转入B型菌，如果没有与DNA复制相关的DNA序列，则不具备自主复制的能力。因此，S型细菌的DNA与R型细菌的DNA应该发生了整合(重组)，才使荚膜基因得到表达。DNA整合的基础是具备相似的序列。已知艾弗里实验中的R型细菌(R36A)来源于S型细菌变异，因此可以断定来自S型与R型细菌DNA组成存在非常高的相似性；来自S型细菌的DNA与R型细菌的基因组DNA发生了遗传重组，这时可以将S型细菌称为“供体”，R型细菌称为“受体”。5 S型细菌的DNA如何被转移到R型细菌体内 从格里菲斯的实验可以看出，错将S型细菌(液)加热当成注射液佐剂，可以使S型细菌中的蛋白质变性，酶结构因破坏而失活，S型细菌不再具有增殖能力。那么DNA如何进入到R型细菌体内呢?艾弗里指出：R型细菌须处于一种能够接受转化刺激的活化时期。细菌的活化时期，是生长早期且旺盛生长的对数期。在液体培养条件下，R型细菌才可以吸附一定数目的DNA并将其转入细胞内；因此当R型细菌与S型细菌的DNA接触时，R型细菌表面有吸附DNA的位点，可将其DNA吸附并转入到体内。艾弗里还指出，接种量过大时转化反而不易成功。DNA需要具备一定长度，才能与细菌表面的受体结合，当表面受体位点饱和后，将阻止其他双链DNA的结合。当S型细菌的DNA被吸附到R型细菌表面受体位点上后，就会“穿入”到R型细菌内，进而发生遗传重组，具体过程是：(1)核酸外切酶或者DNA移位酶( translocase)降解其中的条链，并利用降解这条链产生的能量，将另一条DNA链拉进细胞中，这个过程是不可逆的；(2)进入R型细菌的单DNA与受体DNA配对，由于S型细菌和R型细菌DNA序列相似性很高，因此两者配对的程度很高，转化的可能性也很大；(3)单链供体DNA与受体DNA发生对应位点的置换，从而发生遗传重组，供体DNA被保留在受体菌内，即R型细菌具备了S型细菌的部分性状。6 S型细菌加热温度是多少 教材并未指出采用多高的温度处理S型细菌，其实，当时格里菲斯采用了60℃和65℃的加热温度。非常幸运，这是一个未将S型细菌加热到足以使其DNA变性(DNA双链中的氢键打开)的温度(当时一般采取不超过70℃的加热方式将细菌杀死)；而且艾弗里为谨慎起见，将S型菌液加热温度由60℃升高到65℃，确实发现此时S型细菌失去使R型转化的能力，不过这个温度仍然不足以使DNA变性，而会使细菌培养液中某些成分失活，如使兔血清中破坏转化的酶失活。还有一种说法认为，格里菲斯和艾弗里的加热温度可能会使DNA变性，即能使DNA双链间的氢键断裂使其解旋为单链，但是也会在短时间内复性(解链的DNA恢复为双链)，这种说法得到一些中学教师的认可。不过，从目前常用的PCR技术来看，使DNA氢键打开的温度应该高于72℃(该温度为DNA双链延伸的温度)，有些PCR引物的退火温度高达65℃(引物与DNA模板相结合的温度)。因此，艾弗里采用的温度可以使细菌内的蛋白质变性并使其失去增殖能力，破坏培养液中抑制转化的成分，但遗传物质DNA并未受到影响。7 S型细菌可以自发转变为R型细菌吗 艾弗里指出，R型细菌是从强毒的肺炎球菌SⅡ型培养物经过36代培养后分离的；实际上，R型细菌有多个变异类型，多数菌株没有转化活性，有些在动物体内连续传代，或者在抗R的血清中连续继代培养，可以恢复为原来的特异类型SⅡ型。只有R36A菌株表现出转化的敏感性，为稳定的R型，不能自发恢复为SⅡ型。可以看出，S型细菌在多代继代培养可以转变为R型细菌，这是一种自发的突变；R型细菌有些可以在一定条件下自发恢复为S型细菌,有些则不能。艾弗里选用的R36A菌株不能自身恢复突变为SⅡ型，更进一步证明了实验中R型细菌转变为S型细菌是因为接受了来自S型细菌的DNA，而不是由R型细菌自发突变而成。8 S型细菌是雄性细菌吗 细菌也会像高等生物有雌雄之分吗?1944年，艾弗里证实了DNA可以在细菌之间进行转移；1946年,莱德伯格( Lederberg)和塔图姆( Tatum)证实了在细菌生物化学突变混合物中出现了新的基因型；1950年，戴维斯(B. Davis)通过U型管实验，再一次证明了两个细菌菌株通过直接接触，能够产生新的基因型，这种方式称为细菌的接合；1952年，海斯(W. Hayes)通过实验证明，接合过程中遗传物质是单向转移的。转移的物质一般是细菌的微小染色体，即质粒DNA。含有质粒DNA的细菌被称为供体，由于转移的环状质粒DNA编码致育因子( fertility factor)基因，供体菌又被称为F+，或者雄性菌；而不含有质粒DNA的细菌被为受体，也称为F-或雌性菌。当供体菌与受体菌发生接触时，致育因子得到表达并帮助形成性伞毛( F pills)，性伞毛是供体表面伸出的一种长的附属物，与受体菌接合后形成一个通道，即接合管( conjugationtube)。接合发生的频率很低，一般是10-7。此外，除了F因子质粒与主染色体发生DNA交换重组，插入到主染色体上以外，细菌之间的染色体也可以单向转移并重组到受体染色体上。可以看出，接合是两种活细菌在充分接触下发生的DNA单向转移，而肺炎链球菌的转化则是一种活的感受状态的细菌吸附外源DNA的过程，S型可以称为供体，而不能称为雄性菌，R型细菌可以称为受体菌。关于活细菌之间的DNA转移，近年高考题目中也有所体现，如2018年全国理综I卷选择第6题。例题 (2018年全国理综Ⅰ卷,6)某大肠杆菌能在基本培养基上生长，其突变体M和N均不能在基本培养基上生长，但M可在添加了氨基酸甲的基本培养基上生长，N可在添加了氨基酸乙的基本培养基上生长，将M和N在同时添加了氨基酸甲和乙的基本培养基上混合一段时间后，再将菌体接种在基本培养基平板上，发现长出了大肠杆菌(X)的菌落，据此判断，下列说法不合理的是(C)由题意可知，将M和N在同时添加了氨基酸甲和乙的基本培养基上混合一段时间，说明M和N能够在添加了氨基酸甲和乙的培养基上生存，混合段时间后在基本培养基上长出的X菌则具备了自身合成氨基酸甲和乙的能力，说明两者之间发生了DNA的转移，而这种转移其实就是通过细菌的接合实现的。题干其实也暗含了M具有合成氨基酸乙的能力(编码相关酶的DNA)，N具有合成氨基酸甲的能力，因此重组菌X才会同时具备合成氨基酸甲和乙的能力。不过由于题干较简单，并不能够看出DNA是由M转移到了N，还是由N转移到了M，即哪种是雄性菌哪种是雌性菌。当然，还可以将题目进一步拓展，如设计实验证实DNA在M和N细菌之间转移的方向，可以参考海斯(W. Hayes)的实验。9 肺炎链球菌转化实验对现代基因工程技术的启示 现在人们已经得知，作为基因工程常用的载体，在细菌之间转移的DNA实际上是环状的质粒( plasmid)DNA(线性的也有，较少)。环状质粒DNA是细菌主染色体之外的、可以自主复制的遗传因子，不是细菌生存和繁殖所必需的。但是，环状质粒可以借助细菌的繁殖机制进行DNA复制和基因表达等。一般情况下，一个细胞内不会含有两种不同的质粒，即使同时转入两种不同的质粒，经过传代培养几次后，其中的一种质粒会发生丢失，称为质粒的不相容性。艾弗里实验中S型细菌向R型细菌转移的是其主染色体上的DNA，如果不发生DNA重组，转移的DNA是无法像质粒DNA样完成自主复制的。同时需要注意，在艾弗里实验中，可以观察到第1组至第4组，在培养基上均出现了R型菌落和S型菌落，为什么在R型细菌与S型细菌的细胞提取物混合后仍然出现了R型细菌呢?实际上，这涉及转化效率的问题，并不是所有的R型细菌都得到了转化，因此，才会出现两种菌落。此外，S型细菌菌落更大，易与R型菌落区分，但是在新旧教材上均未刻意区分这一点，这也是需要注意的问题。为了提高转化效率，基因工程常用冰冷氯化钙制备感受态细胞(菌)，使细菌也处于生长早期且旺盛生长的对数期。感受态细胞的细胞膜通透性较大，且细胞内一般没有质粒DNA存在，所以其吸附外源DNA的能力或者说使DNA转化的能力大大增强,提高了转化效率。综合以上分析可知：(1)S型肺炎链球菌是因问为具有荚膜而免受机体吞噬细胞的破坏导致生物发病或者死亡；(2)S型细菌不仅可以向R型细菌转化编码荚膜基因的DNA，还可以转移控制其他性状的DNA，转移的这些DNA位于S型细菌的主染色体上；转移到R型细菌的DNA被整合到了R型细菌的主染色体上，前提是S型细菌与R型细菌具有高度的同源性；(3)格里菲斯和艾弗里加热S型细菌的温度足以使蛋白质变性导致细菌死亡，但并没有破坏DNA；(4)DNA转化不同于细菌接合，前者是细菌吸附外源DNA的过程，要求细菌处于生长对数期。后者是两种活的细菌接触并发生了DNA的转移，转移的DNA可以是质粒DNA，也可以是主染色体DNA，这种转移是单向的；(5)DNA转化赋予了受体细菌新的性状。张爱玲，涂红艳，范玉婵，温仕红，肖望，“肺炎链球菌转化实验”背后的科学问题，中学生物教学，2021，11 编辑：小呆呆
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