核酸和蛋白定量方法，还可以怎么选?

刘得光3p6n6zqq 2021-11-17

展开全文

进入21世纪，生物学研究领域越来越宽，但核酸和蛋白定量仍然是其他研究的基础。光吸收法（UV-Vis）和荧光检测法是最常用的两种核酸和蛋白定量技术。根据不同的实验需求，通量要求选择合适的测量方法，可节省大量时间和人力成本。

本文为您梳理了实验原理，方法，所需仪器、试剂和耗材，帮您快速get到实用信息。

光吸收法（UV-Vis）

检测原理：测量入射光穿过样品后到达检测器的衰减程度，并表示为溶液中样品的吸光度值。

核酸和蛋白光吸收法法测量是基于核酸（DNA 和 RNA）和蛋白质的固有吸收特性。当测量吸收光谱时，核酸在 260 nm 蛋白质在280nm处吸收具有特征峰。

根据 Beer-Lambert 方程，使用在 260 nm 或280nm处测得的吸光值直接计算核酸或蛋白浓度：

其中：

● C=核酸摩尔浓度（M）

● A=UV 吸光度（AU）

● ε=与波长有关的摩尔吸光系数（或消光系数）（M^-¹cm^-¹）

● L=光程（cm）

➤ 基于光吸收法的RNA/DNA核酸和蛋白质定量仪器

1. 超高灵活通量Multiskan SkyHigh或Varioskan LUX

1.1. 紫外直接定量法

Thermo Scientific™ μDrop™ 或 μDrop™ Duo 板，配合Multiskan SkyHigh或Varioskan LUX可实现单次16个或32个样本的超微量测定。

紫外透明塑料板和石英板板材本底信号光谱扫描图

Thermo Scientific™ 紫外透明（UV trans）塑料板（货号8404），配合Multiskan SkyHigh或Varioskan LUX可实现单次96个样本的高通量测定，相较于石英板使用成本更低。

Multiskan SkyHigh或Varioskan LUX直接紫外测量特点：

● 采用μDrop™ 板，16个样品测量时间小于1分钟

● 采用μDrop™ 或 μDrop™ Duo 板样品体积低至2μl；

96孔板样品低至50 μl（建议70μl以上，样品检测后可以直接封膜保存，无任何浪费）

● Multiskan SkyHigh带比色杯基座款，还可实现不同规格比色杯测量

● Multiskan SkyHigh带屏幕款还可快速实现单机检测

● 药研版软件符合美国21 CFR Part 11 要求

1.2. 可见光检测蛋白浓度

使用Multiskan SkyHigh或Varioskan LUX配合不同的蛋白定量试剂可进行至多384孔板的蛋白浓度定量检测。

荧光检测法

检测原理：基于所使用的选择性结合 DNA / RNA 或蛋白的荧光染料，这些荧光染料仅在与靶标结合时才发出信号。比传统基于紫外吸收光度法的定量更灵敏，是珍贵样品的理想选择。

样品被过滤光激发（在激发波长处）并由检测器记录发射光（在发射波长处）。

➤ 选择基于荧光检测法的仪器进行 RNA/DNA核酸或蛋白质定量

1. 经典单通道Qubit 4或八通道Qubit Flex荧光计

● 所需样品体积低至1μl

● Qubit 4/Qubit Flex测量时间≤3 秒

▲ Qubit 4/Qubit Flex测量实验操作流程

即使在样品中有同等量的RNA时，Qubit^TM1X dsDNA HS Assay Kit（货号Q33231）只选择性的结合dsDNA，并具有0.2–100 ng线性定量范围。

对于蛋白质定量，Qubit 宽范围蛋白定量试剂（A50668，A50669）可在Qubit 4荧光计上对蛋白样品进行快速、灵敏、准确的浓度分析，线性范围宽达0.1–20 mg/mL，所以大多数未稀释的样本可直接定量，并且蛋白间差异很低。定量结果可在Qubit 4上一键获取，无需手工计算。

如上图，对于不同细胞裂解物的蛋白定量，Qubit Protein BR Assay 较常规 Bradford法具有更低的CV值。

2. 超高通量Fluoroskan 系列或Varioskan LUX

● 所需样品体积低至1μl

● 96个样品测量时间不超过25秒

● 可以进行384孔的高通量检测

● 药研版软件符合美国21 CFR Part 11 要求

▲ Fluoroskan 系列或Varioskan LUX测量实验操作流程

即使在样品中有同等量的RNA时，Quant-iT 1X dsDNA HS Assay（货号Q33232，最佳激发502nm最佳发射523nm）只选择性的结合dsDNA，并具有0.2–100 ng线性定量范围。

Quant-iT™蛋白测定试剂盒（货号Q33210，最佳激发470nm最佳发射570nm）测定的蛋白样品体积为1–20 μl，检测范围为0.25–5 µg。上图显示了在规定的检测范围内9种不同蛋白质产生的荧光信号。对于所有测定的9种蛋白质，在3 µg浓度的蛋白质间差异为12％，去除碱性组蛋白后差异则为9％。