聚合酶链(式)反应(
polymerase chain
reaction,PCR)是体外扩增DNA序列的技术。它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学实验的工作基础。在这三种实验技术中,PCR方法在理论上出现最早,也是目前在实践中应用得最广泛的。PCR技术使微量的核酸(DNA或RNA)操作变得简单易行,同时还可使核酸研究脱离于活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命,极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展
PCR发展简史
核酸研究已有100多年的历史,20世纪60年代末、70年代初,人们致力于研究基因的体外分离技术,但由于核酸的含量较少,在一定程度上是限制了DNA的体外操作。
Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可合成tRNA基因”。但由于基因序列分析方法尚未成熟,热稳定的DNA聚合酶尚未报道,以及寡聚核苷酸引物合成还处在手工及半自动合成阶段,这种想法似乎没有实际意义。
1983年美国科学家
Kary
mullis驱车在蜿蜒的州际高速公路上行驶时,孕育出了PCR的雏型。经过两年的努力,在实验上证实了PCR的构想,并于1985年申请了有关PCR的第一个专利,在“
science”杂志上发表了第一篇PCR的学术论文。从此PCR技术得到了生命科学界的普遍认同。 Kary
mullis也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。但 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的
Klenow片段,这虽然较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于
Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术成了一种笨拙的中看不中用的实验室方法。
1988年初, Kechang改用T4DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。
1988年
Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌( Thermus
aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶耐高温,在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶,从而极大地提高了PCR扩增的效率。为与大肠杆菌聚合酶
I Klenow片段区别,将此酶命名为TaqDNA聚合酶( Taq dna
polymerase)。此酶的发现使PCR方法得到了广泛的应用,也使PCR成为遗传与分子分析的根本性基石。
在以后的10多年里,PCR方法不断地被改进。例如,应用具有3′-5修复活性的热稳定DNA聚合酶代替不具3-5修复活性的
Taq DNA聚合酶,减少了在扩增过程中产生的错误配对,大大提高了在复制过程中的真实性。后来发现了几种具有高保真性的 Taq
dNA聚合酶,在常规PCR成熟之后,又衍生出很多适用于其它目的的FCR方法。原来的PCR只能扩增两段已知序列之间的DNA,现在可以扩增到巳知序列两侧的未知序列(染色体步移法),甚至可以扩增到序列未知的新基因2。PCR的模板也从原来要用的DNA发展到直接用RNA作为模板,即反转录PCR,这就使得从真核生物中扩增目的基因变得很容易。PCR原本是一种定性的方法,只能回答样品中有无目的基因存在,现在已经可以用来定量,即回答样品中原始模板的确切数目,这就是所谓的实时定量PCR。基于完整的基因组
DNA
PCR扩增的片段也从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。PCR也从单纯用来扩增基因到能将两个以上的基因连接起来,省去了限制性内切酶消化和用连接酶连接,这就是所谓的克隆PCR3。再加上PCR方法与其它方法联合应用,到目前为止已报道的衍生PCR方法有几十种之多。目前实时荧光定量PCR被广泛应用,因为它不仅可以定性而且可确定原始样品的量。为了适合于大样本的检测,最近又建立了芯片PCR,还可将PCR的结果用数字来表示,这就是所谓的数字PCR(
digital PCR)。
总之,自PCR方法被建立以来,在20多年的时间里,发展很快,已有一系列PCR方法被设计出来,并广泛应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科学研究中。PCR的建立大大地推动了生命科学的发展。由于PCR的实用性和极强的生命力,PR方法还将会被不断完善,进一步在生命科学研究中发挥更大的作用。
