1.实验技术-收藏吃灰去，深入浅出常规PCR

jianggy001 2023-06-12 发布于上海

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1.PCR 原理与过程

2.PCR 体系组分

3.PCR 应用

4.PCR 常见问题及解决方案

前言

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是现代生物学中一项必不可少的技术，能进行体外扩增DNA序列，为基因组研究和分子诊断提供了有力的工具。

那么同时PCR作为NGS高通量测序绝大数建库过程中一必不可少的环节,也是生信人要了解的上游分析的一个内容。这里将从科普角度浅析回顾记录PCR的内容。

PCR原理与过程

PCR原理

是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板以特定引物为延伸起点，利用脱氧核苷三磷酸 (dNTP)，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

PCR过程

变性:模板DNA经加热至93C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;

退火:模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合

延伸:DNA模板--引物结合物在TagDNA聚合酶的作用下，温度一般为72C，以dNTP为反应原料，把序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。将这些步骤重复(“循环”)25-35次，即可按指数方式获得精确的目标DNA拷贝。

PCR 体系组分

2.1 模板DNA

PCR模板可以是任何DNA来源，包括基因组DNA (gDNA)、互补DNA(CDNA)和质粒DNA。

大黑：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。

1.核酸提取的DNA模板完整性差、纯度低、用量不足、长片段或高GC等会导致扩增得率低甚至没有扩增；

2.DNA模板过多、完整性差、长片段或高GC等复杂序列会导致非特异性扩增或条带模糊。

2.2 引物

人工合成具有特定序列的寡核苷酸作为引物，该引物序列与进行扩增的目的核酸片段互补匹配，从而开始目的片段的扩增。

注意：

A.引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度

B.引物与起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性，以确保目的片段的特异性扩增。

大黑：引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

引物设计有问题或用量过多,导致非特异性情况或假阳性扩增（比如引物二聚体等）。

引物设计是一个比较重要的环节，需要深入去挖掘。

2.3 dNTP

DNA复制需要四种脱氧核糖核苷酸，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP。dATP（脱氧腺苷5'-三磷酸）和dGTP（脱氧鸟嘌呤5'-三磷酸）构成嘌呤。dTTP（脱氧胸苷5'-三磷酸）和dCTP（脱氧胞苷5'-三磷酸）构成嘧啶。

大黑：在PCR反应中，注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。

2.4 Taq DNA聚合酶

DNA聚合酶（DNA polymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶 , 以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP 等的情况下）及其相辅的活性。在PCR扩增里，我们常说的Taq酶和高保真酶（Pfu）就是DNA聚合酶。

DNA聚合酶的四大特点——特异性、热稳定性、保真度和合成能力，使这些酶具有多种功能，进一步拓展它们在PCR中的应用。

大黑：DNA聚合酶的一般特征包括热稳定性、合成能力、特异性、保真度。

DNA聚合酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

2.5 PCR buffer 、 Mg 2+

PCR buffer（缓冲液）能够为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境。缓冲液pH通常为8.0-9.5，镁离子（Mg2+）作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键（如下图）。