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对于高等真核生物（特别是高等植物）来讲，它们的基因组一般比较复杂，通常伴随着较高的杂合度或者重复序列等，进行基因组De novo也并非一件容易的事情。特别是进行高精细基因组图谱的构建时，只基于常规DNA文库的二代测序根本无法满足需要，还需结合三代测序、BioNano、Hi-C数据等才可获得高质量的基因组。相对而言，这时的测序成本也会是相当大的一笔开销，需要谨慎对待。因此在对高等真核生物进行全基因组De novo之前，我们需要设法提前获知该物种基因组特征的一些信息，为后续的测序方案、基因组组装方案、基因组结构注释等提供参考依据。这种情况下，我们一般会在基因组大规模测序或者正式组装之前，首先构建DNA小片段文库进行中低深度的二代测序，使用PE文库测序所得的reads信息进行基因组Survey分析以初步评估基因组特征。基因组Survey分析的核心内容即为k-mer分析，使用k-mer分析可直接在相对较小数据量的二代测序reads水平上进行，对该物种基因组大小、GC含量、杂合度高低以及重复序列比例等进行评估。mer : 分子生物学领域中意义为：monomeric unit ( mer) ：单体单元，相当于nt或者bp。通常用于双链核酸中的单位，100 mer DNA相当于每一条链有100nt，那么整条链就是100bp。k-mer是指将reads迭代分成包含K个碱基的序列，一般长短为L的reads可以分成L-K+1个k-mers。例如：一条长为150bp的reads，截取了17bp的碱基序列，那这17个碱基的片段就是17 k-mer，经过迭代选取会产生150﹣17﹢1个k-mer。（3）将k-mer设置为奇数，多测试几次，如：设置K-mer=17，19，21，23，25，27分别计算基因组大小，查看重复序列或杂合度。二代测序后产生了n_r个reads，可知所有的k-mer总数为：n_a=(L﹣K﹢1)*n_r通过观察k-mer分析的k-mer频率分布图（图1），可以得到k-mer深度期望，记为d_k 
由于k-mer中还有一些错误序列，因此在估算基因组大小的时候要考虑去除误差。理论上单拷贝序列的k-mer一般都分布在2倍主峰之前，2倍主峰之后出现的k-mer被认为是重复序列，所以我们取峰值2倍后的k-mer为重复k-mer，从而得到重复k-mer的总数记为T（T，相当于重复序列的k-mer总数，即2倍深度后的k-mer频率乘以k-mer数的总和；或者是在分布图中的2倍峰后面的总面积，纵轴为k-mer数），从而可以计算出重复序列的长度为：
假设基因组中的杂合率为h（每个碱基为杂合点的概率）,对于一个k-mer，它是纯合k-mer的概率为：P1=(1﹣h)k则它是杂合的概率为：P2=1﹣P1=1﹣(1﹣h)k 因此，在二倍体中单拷贝区域的同源区域，会产生U*P2个杂合k-mer。杂合的k-mer数可以通过计算得到：只要统计非重复k-mer的总数，记为Ut（Ut可以从分布图中计算面积得出），Ut-U即为产生的杂合k-mer数。 因此，Ut﹣U=U*P2=U*(1﹣(1﹣h)k) 已知Ut、U、k，从上面等式中即可解出h，也就是杂合率。在理想状态下，k-mer曲线服从泊松分布，即只会出现一个明显的主峰。因此，当基因组中不存在杂合区和重复序列，或者杂合度较低、重复序列在整个基因组中占比较少时，通常会看到如下图所示的K-mer频率分布图。但自然界的物种经过亿万年的进化，基因组复制、杂交等情况多有发生，因此，基因组中往往会含有不同比例的重复序列、杂合位点，使得k-mer曲线不会呈现出良好的泊松分布。从图2中看出，最左侧（Frequency=1、2等起始位置处）出现了很高的值，表明测序结果中存在大量的k-mer仅出现了1-2次，这个在k-mer频数统计表中也可轻易发现。这是因为在实际的二代测序数据中，由于测序错误（如Illumina测序平台的平均错误率约1%）的存在会引入许多带有错误碱基的reads，将这些reads打断成长度为K的k-mer后，会产生许多错误的k-mer。由于测序错误带来的碱基类型是随机的，因此可知这些错误k-mer的出现频数很低，但总数目却非常的多。因此在图2中看出，低频数的k-mer数目占很大的比例，即在Frequency=1、2等起始位置处出现很高的k-mer数目，使得图中曲线峰值高。峰值位置d_k就是k-mer深度期望。物种的二代测序reads数据的k-mer频数分布曲线图中只存在一个明显的主峰，说明该物种个体为纯合体或单倍体，且其基因组构造简单几乎不存在重复序列。基因组复制事件会使基因组中产生大量的重复序列。重复序列的存在使得基因组中某一个K的K-mer序列增多，即K-mer的出现频率增加，在进行K-mer分析时，表现为主峰拖尾或在主峰后对应横坐标的整数倍处出现重复峰（图3）。但重复序列的多少并不会影响重复峰的位置，只会削低峰的高度。当基因组中重复序列占比较高时，通常会选取大一点的K-mer以跨越重复序列，提高组装效果。图中，Frequency=55处是主峰，主峰位置之后Frequency=110（约为主峰位置2倍处）及Frequency﹥110后面的拖尾被认为是由基因组中的重复序列导致。图3中，在x=a处出现主峰，x=2a处有一个次峰，说明一部分片段出现的期望值是大部分的2倍，这些片段为重复片段，次峰为重复峰。在高杂合基因组中，序列中的杂合位点会使得K-mer分成两个部分，序列中某些碱基的覆盖深度也会相应减半。因此，与纯合序列相比，杂合片段中K-mer的覆盖深度会下降50%，最终在K-mer曲线上表现为：在主峰前对应横坐标的1/2处出现一个小峰，且基因组的杂合度越高，该峰越明显。如下图4所示，Frequency = 90处是主峰，主峰位置之前Frequency = 45（约主峰位置1/2处）被认为是基因组杂合导致的。图4中，在x=2a处出现主峰，x=a处有一个次峰，说明部分片段出现的期望值是大部分的1/2，当序列有杂合时，包含杂合位点的k-mer因为分成了两部分，所以出现频率变为一半，次峰为杂合峰。图5 某高杂合或高重复物种基因组K-mer频率分布图图5中，分别在x=a、x=2a处各出现一个峰，因两个峰高相差不大，两峰横坐标又是2倍关系，说明该个体高杂合或高重复。在利用二代数据进行基因组Survey时，借助K-mer分析能够初步获得基因组大小、重复序列比例、杂合度等信息。K-mer分析时，若基因组中含有较多重复序列，通常会在主峰后形成拖尾或在对应的横坐标整数倍处出现重复峰，而当基因组中含有杂合位点时，则会在主峰前1/2位置处形成一个小峰。基因组大小、重复序列比例、杂合度等信息的获得，能够为基因组测序深度、组装软件的选择、冗余去除等生信分析流程提供依据，提升组装基因组的质量。实用科研工具推荐
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