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摘要 基因工程中常用两种限制酶酶切质粒和目的基因，可以为防止错误连接及自身环化、和反向链接。但实际操作中要考虑到目的基因两端可能没有两种限制酶的酶切位点；若是人工合成需要人为的加上粘性末端。 例1 2016·全国卷Ⅰ节选：某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题： (2) 如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是 ① ；并且 ② 和 ③ 的细胞也是不能区分的。其原因是 ④ 。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有 ⑤ 的固体培养基。 答案：① 二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长; ②含有质粒载体（空载）;③含有重组质粒;④二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长;⑤四环素 解析：目的基因和载体有同一种酶酶切后，会形成相同的粘性末端，再用DNA链接酶催化时，会有下图的三种情况。且上述题目中，目的基因插入破坏了四环素的抗性基因，因此导入了重组质粒的受体菌，可以在含有青霉素的培养基生长，但不能在含有四环素的培养上生长。 例2 科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并在大肠杆菌中成功表达。如图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。 请据图回答问题。 （1）图中质粒上有抗氨苄青霉素和抗四环素两个标记基因，经过①和②步骤后，有些质粒上的 基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒，由于目的基因的分隔使得该抗性基因失活。 （2）步骤③是 的过程，为了促进该过程，应该用 处理大肠杆菌。 （3）步骤④将三角瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培养基Ｃ上培养，目的是筛选 ，能在Ｃ中生长的大肠杆菌有 种 （4）步骤⑤：用无取Ｃ上的单个菌落，分别接种到Ｅ（含四环素），然后用影印法接种到D（含氨苄青霉素和四环素）上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的 菌落位于 （填Ｄ或Ｅ）上，请在图中相应的位置上圈出来。 答案（1）氨苄青霉素抗性；（2）将重组质粒（目的基因）导入大肠杆菌（受体细胞）CaCl2溶液；（3）含四环素抗性基因的大肠杆菌 ２ ；（4）E 例3 2018浙江温州3月选考模拟 利用图示质粒和目的基因培育转基因醋化醋杆菌。图中标注了相关限制性核酸内切酶的识别序列和酶切位点,其中酶切位点相同的酶不重复标注。请回答下列有关转基因的问题: (1)利用图示质粒和目的基因构建重组质粒,应选用 两种限制酶切割。 解析：为防止错误连接（包括反向链接）和自身环化应采用BamHⅠ和HindⅢ两种限制性核酸内切酶切割。 2020年1月浙江高考29：为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用____________，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的粘性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中________，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。 答案：两种限制性核酸内切酶 扩增 |
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