干细胞疗法：从神话到现实
撰文：徐 潇
来源：医学参考报
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干细胞包括各种具有自我更新和分化特性的细胞。干细胞移植用于临床疾病的治疗已有几十年历史，所涉及细胞包括成体干细胞（如造血干细胞、间充质干细胞）以及多能干细胞（如人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞）。从第一例干细胞移植到现在，干细胞领域发生了巨大变化。第一代是基于成体干细胞的疗法，是临床使用的第一代干细胞。第二代是基于多能干细胞的疗法，则代表了第二代干细胞。
基于这两代干细胞疗法的不足，科学家们通过细胞工程技术进行了改造，大大扩宽了干细胞的治疗用途。本文首先概述了开发新一代干细胞治疗的关键工具，然后讨论新一代干细胞在肿瘤、基因治疗、组织修复等方面的应用。
1 基于“编辑工具”的干细胞
病毒介导的干细胞转导
病毒介导的外源基因转导可用于驱动干细胞表达其通常不表达的蛋白质（如前药转换酶、嵌合抗原受体等）。转基因也可用于过表达干细胞中的某类蛋白（如具有营养或修复作用的生长因子）。
研究人员通常将某特定基因通过RNA 逆转录病毒（如丙型反录病毒、慢病毒）， 整合到基因组中，令其在细胞中稳定、长期表达。然而，技术也存在一定的风险，如可能会存在破坏了抑癌基因的功能的概率，导致肿瘤的发生。
其他工具还包括仙台病毒、腺病毒、腺相关病毒（AAV）DNA或RNA的核切和电穿孔、纳米颗粒和脂质体及阳离子聚合物。然而，这些工具要么只能暂时让细胞表达某个基因，要么转染效率低。相对来说，第三代自灭活慢病毒的安全性和长期转基因表达能力支持了它们在新一代干细胞治疗中的应用。
基因编辑工具
基因编辑能够对特定的基因组位点进行靶向编辑，可用于纠正或功能性补偿基因突变，敲除内源基因等。基于核酸酶的基因编辑系统，常用的有锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活子样效应核酸酶（TALENs）和CRISPR-Cas系统。
ZFNs和TALENs通过特异的DNA结合蛋白与DNA靶位点结合，在非特异性的核酸酶FokⅠ的作用下引起生物基因组靶位点DNA双链断裂。而CRISPR-Cas9则通过小分子向导RNA以碱基互补配对方式与DNA序列靶位点结合，引导Cas9蛋白到靶位点并对DNA产生剪切作用，从而造成基因组靶位点DSBs，形成的DSBs会启动真核细胞DNA修复机制。
ZFNs和TALENs合成和组装程序较为复杂，而设计相对简单的CRISPR-Cas系统在问世后迅速得到推广，然而该技术存在脱靶编辑的可能。因此，为了使这项技术在临床应用中更加安全，针对CRISPR脱靶效应的检测至关重要。
其他工具
除了基因治疗和基因编辑，其他工具正在被用于创建和改进新一代干细胞，包括光遗传学、化学遗传学。光遗传学利用光反应蛋白激活细胞内信号通路，控制外源性基因表达、诱导内源性基因转录。在干细胞治疗中具有潜在的临床应用价值。化学遗传学则是利用化学物质控制体内细胞活性，在帕金森病及癫痫的临床前动物模型中有良好的表现。
2 基于“药物递送”的干细胞载体
干细胞具有天然趋向肿瘤转移的特性，因此可以作为药物递送载体。科学家们将抗癌药物包裹于干细胞内，使其更易进入肿瘤或趋近肿瘤，同时也可以降低抗癌药物的全身性毒性。
目前，神经干细胞（NSC）和间充质干细胞（MSCs）已被应用于递送抗肿瘤药物。第一，免疫原性低，第二，具有肿瘤趋向性，这些干细胞会根据肿瘤分泌的化学引诱剂、血管生成因子或炎症信号向其迁移。最有前景的方法，当属通过干细胞装载前药转化酶、凋亡诱导剂或溶瘤病毒（OVs）来治疗肿瘤。
递送前药转化酶
在肿瘤治疗中，通过干细胞递送前体药物转化酶到肿瘤部位，可促进无毒的前体药物在局部转化为细胞毒性形式，减少药物潜在的毒副作用。这种方法当然也有挑战，前提就是需要制造大量具有肿瘤趋向性的干细胞。目前，已有多项临床试验在进行，作为治疗难治癌症的药物输送工具。
递送凋亡诱导剂
干细胞也可用来递送凋亡诱导剂，用于治疗恶性肿瘤（脑肿瘤、非小细胞肺癌和胰腺癌）。大名鼎鼎的干细胞胞外囊泡（EVs），也可被作为一种用于递送凋亡诱导剂和抗癌药的工具。因为不涉及干细胞体内复制，避免了肿瘤产生的潜在风险。干细胞胞外囊泡，不仅比使用干细胞本身具有安全优势，与合成脂质体或纳米颗粒相比，其免疫原性更低。
递送溶瘤病毒
溶瘤病毒（Oncolytic viruses，OVs）可利用细胞表面标志物侵入到肿瘤细胞中，选择性杀伤癌细胞。然而OVs会触发机体的抗病毒免疫，限制其功能的发挥，通过干细胞包装OVs可避免上述问题。目前，基于溶瘤病毒技术的干细胞疗法临床试验有两项：一项是基于溶瘤病毒技术 NSC 疗法（NCT03072134）处于 I 期临床试验，用于治疗恶性神经胶质瘤；另二项是基于溶瘤病毒技术 MSCs 疗法临床试验（NCT02068794），用于治疗复发性卵巢癌。
3 基于“基因工程”的干细胞疗法
干细胞本身可作为治疗药物，用于免疫肿瘤学、组织修复和遗传性疾病治疗等多种用途（目前，在肿瘤治疗和遗传病方面，造血干细胞的基因改造比较常见）。在肿瘤治疗方面，干细胞可提供长期抗原特异性免疫，且通过细胞分化可为肿瘤患者提供现成的抗原特异性免疫治疗。在组织修复方面，干细胞可过表达神经营养因子、抗炎细胞因子或血管生成因子，以促进因损伤或疾病而受损的组织的愈合和恢复。在遗传性疾病中，干细胞则被用于纠正致病突变。
因此，需找到合适的基因工程改造方法，才能确保整个治疗的安全性，同事使干细胞保持必要的持久性，达到足够的治疗效果。
抗原特异性免疫激活
过继性细胞疗法已探索数十年，表达抗原特异性TCR或CAR的工程化T细胞在血液肿瘤治疗上，临床效果显著，其开发在如火如荼进行中。TCR和CAR技术不仅可直接用于免疫细胞改造，也应用于直接改造干细胞中（诸如包括造血干细胞，间充质干细胞和多能干细胞等）。与CAR免疫细胞相比，CAR-造血干细胞的优势在于可以延长抗原特异性免疫反应效果，扩大其在治疗艾滋病和实体瘤中的应用。
内源性组织修复
经过改造的干细胞本身可作为治疗药物，通常是通过自身过表达神经营养因子、趋化因子、抗炎症分子、血管生成因子，有助于组织恢复和内源性修复，通常用于治疗中枢神经系统疾病（慢性缺血性中风和创伤性脑损伤）、心脏病、动脉粥样硬化等疾病中。
基因治疗
基因治疗旨在为具有遗传突变疾病的患者提供功能正常的基因替代物。目前，造血干细胞基因疗法是临床研究的重点领域，可作为治疗遗传性血液病、原发性免疫缺陷等疾病的可选途径。除造血干细胞外，治疗遗传性疾病的干细胞基因疗法也在探索中。大疱性表皮松懈皮肤病的基因治疗就是其中一种。
4 文末小结
干细胞领域在过去的60年里发展迅速，从基于原始干细胞的第一代干细胞到基于多能干细胞的第二代干细胞，虽然它们的临床应用潜能巨大，然而不同类型的干细胞也存在一定的不足，阻碍了其临床应用。
目前正在临床试验的新一代干细胞包括肿瘤亲和性的MSCs和NSC， 用于递送前体药物转化酶以及新型抗肿瘤药物治疗肿瘤。表达抗原特异性TCRs或CARs的HSC用于防止癌症复发或艾滋病毒感染正在进行临床试验；经过基因编辑的HSC正在血红蛋白病或艾滋病毒患者中开展临床试验，以确定改造后的干细胞在体内是否长期有效。化学发生和光发生的手段可用于控制改造后的干细胞衍生物在体内的命运转归及活性的方法。
尽管目前新一代干细胞的应用还存在许多生产及管理上的问题，但随着技术的发展，未来新一代干细胞在临床治疗上将大有可为。
（本文来源于《医学参考报》干细胞与再生医学频道）（ID ：yxckbsc2020040801）
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