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PCR原理 聚合酶链式反应，PolymeraseChain Reaction （PCR），简单来讲，其就是利用DNA分子会在体外95°高温时会发生变性解旋变成单链，然后降温到60°C左右时引物会与单链DNA按碱基互补配对原则结合，接着再升高温度到72°C左右，即DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶会沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成相应的互补链，如此循环往复以达到DNA分子扩增的目的。 PCR技术诞生 最早核酸体外扩增的设想是由Khorana于1971年提出，但是，由于当时的基因序列分析技术尚不成熟，且对热具有较强稳定性的DNA聚合酶也还没有被发现，这种设想在当时来讲似乎没有任何实际意义。随后，在1985年，美国科学家Kary Mullis实现了这个设想，发明了PCR技术。 自从美国科学家Kary Mullis发明PCR方法以来，当前该方法已经成为生命科学研究领域中最常规的实验方法之一。通过PCR扩增技术，其产物应用于下游多个领域，比如克隆表达、芯片杂交、突变检测以及基因测序等等。 PCR技术发展 PCR技术诞生至今，随着生命科学领域以及延伸领域的应用需求，PCR技术已经经过了三代突破性的更迭，使其应用范围越来越广泛。 第一代PCR是基于电泳技术对PCR产物进行分析，主要针对的分析对象是条带，分析内容主要有这样三类：条带大小、条带数量、条带浓度。简单来讲就是看核酸分子电泳条带。研究人员可以根据电泳条带的这些信息达到相应的实验目的，比如制备的DNA片段、检测目的序列、对目的基因表达进行定性分析等等。然而，第一代PCR技术有一个很大的缺陷——无法实现精确定量。 第二代PCR技术即荧光定量PCR技术，其是通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测荧光的积累，依据荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。简单来讲即根据反应体系的荧光强度来判断产物浓度。但该技术目前只有在规范的实验流程以及统一的实验设计思路下，得到的结果才能具有可重复性和可比性；且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测的灵敏度、精确度都会受到限制。 第三代PCR即数字PCR应运而生，很好地弥补了第二代PCR技术在定量方面的缺陷，它可以直接计数目标分子，不再需要依赖任何校准物或外标，就可以确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。第三代PCR技术简单来讲就是数目标分子，而要实现这一过程的关键在于采用某种分散技术，该技术能够使一个完整的PCR反应体系分散成为成千上万个独立的PCR反应体系，且每个PCR反应体系中只包含一个或零个模板。 核酸样品的分散是第三代PCR技术中非常重要的一步，也是最核心的一步。目前，其从最早期的96或384孔技术发展到如今已经可以将反应体系缩小至纳升或皮升级别。 当前主流的核酸样本分散方法主要有两种：1) 以ThermoQuantStudio™ 3D数字PCR系统为代表的微流控芯片法，2）以BIO-RADQX200™数字PCR系统为代表的微滴法。有兴趣可以关注下这两代表性的分散方法~ |
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