【新知解读】二代测序核酸质控环节怎么做？看完就懂！

核酸质控是NGS（Next Generation Sequencing）实验中必不可少的环节，精确的NGS实验结果也离不开合格的核酸质控。核酸质控主要是评估核酸的浓度，完整性、纯度及片段大小。

核酸样本涉及的下游实验很多，质控不合格会影响实验结果的准确性，甚至得到错误的结论。NGS实验中使用质量差，如降解程度高的核酸样本建库可能导致文库浓度低，文库复杂度低，甚至文库构建失败等；文库浓度定量不准确可能导致测序实际分配数据量不均，或簇密度波动甚至导致实验失败。详情可参考往期内容【新知解读】测序失败风险排查——多的是你不知道的事

现在市面上主流的核酸质控方法有紫外可见吸收光度法（UV-Vis）（如Nanodrop）、荧光染料法（如Qubit）、琼脂糖凝胶电泳法（如Gel-electrophoresis）、自动化电泳法（如2100 Bioanalyzer）、荧光定量PCR法（如qPCR）等。

如何挑选合适的核酸质控方法来保证NGS实验的顺利进展？相信是小伙伴们十分关注的问题。不要担心！今天小石头带大家来回顾各种核酸质控方法的原理及应用。

常用的核酸质控方法

01

紫外可见吸收光度法

生物有机分子中的芳香环，具有紫外吸收的特性。核酸，蛋白质、多肽、芳香基团、苯酚以及碳氢化合物均可吸收紫外光。核酸在260 nm波长处具有最高吸收峰，蛋白质在280 nm波长处具有最高吸收峰，碳水化合物在230 nm波长处具有最高吸收峰 。

根据朗伯-比尔（Beer-Lambert）光吸收定律：当一束平行单色光垂直入射通过均匀、透明的吸光物质的稀溶液时，溶液对光的吸收程度（K）与溶液的浓度（c）及液层厚度（b）的乘积成正比。即：A=Kbc，式中K为吸光系数；A为吸光度；b为溶液液层厚度（或称光程长度）；c为溶液浓度。

一般在260 nm下，1 μg/ml DNA溶液在1 cm光径比色皿中的吸光系数为0.020，1 μg/ml RNA溶液在1 cm光径比色皿中的吸光系数为0.022。

紫外分光光度计能通过测量入射光穿过样品后到达检测器的衰减程度，来表示为溶液中样品的吸光度值，通过测定吸光度值即可得出待测样本的浓度。与此同时，还能通过计算A260/A280 和A260/A230的数值，评估核酸的纯度。较纯净的核酸A260/A230应大于2.0；较纯净的DNA A260/A280在1.8-1.9，较纯净的RNA A260/A280在1.9-2.0，样品中如果含有蛋白质及苯酚，A260/A280比值会明显下降。

图1. 紫外可见吸收光度法原理示意图

实验室中紫外可见光度法定量RNA/DNA广泛使用的是 Nanodrop系列分光光度计。

其优势是：操作简单，无需样本制备、染料或标准品；可以直接测量纯度比—A260/280 和 A260/230；部分仪器还可识别样品中的非核酸污染物。其缺点是：不具有选择性（无法区分 DNA 或 RNA）；灵敏度有限，无法完成低浓度样本的精确定量。

图2.  Nanodrop仪器

02

  荧光染料法 

基于所使用的是能与特异的靶分子结合的荧光染料，可选择性结合 DNA、RNA 或蛋白，这些荧光染料仅在与靶标结合时才发出信号。

样品被过滤光激发（在激发波长处）并由检测器记录发射光（在发射波长处）。荧光计可根据激发波长和发射波长测量特异性结合在生物分子和天然荧光分子上染料的荧光信号强度。

通过已知浓度的标准样品绘制校正曲线，并将样品的荧光信号拟合到适当的回归模型中，即可测量核酸浓度。

图3. 荧光检测法原理图

实验室中用荧光染料法测定核酸浓度常用Qubit荧光计。其特异性和敏感性比紫外分光光度计更高，但无法提供核酸纯度信息，也无法检测文库中的非特异性片段，如引物二聚体，接头序列等。

根据靶向分子的不同，Qubit包含dsDNA/总RNA/microRNA/ssDNA/蛋白质检测试剂盒，NGS实验中样品定量常用Qubit™ 1X dsDNA HS检测试剂盒。

图4 Qubit荧光计及其检测试剂盒

03

 琼脂糖凝胶电泳法

该技术是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法，其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

如检测DNA时，由于DNA在碱性条件下带负电荷，在电场中往正极移动，不同DNA由于分子量和分子构型不同，在电场中的迁移速率也不同，从而分离出不同的条带。

图5. 琼脂糖凝胶电泳检测示意图

琼脂糖凝胶电泳可定性分析样本浓度，片段大小、完整性及纯度，但不能准确定量。福尔马林固定石蜡包埋样本（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE）是NGS肿瘤基因检测最常用的样本之一。在文库构建之前，常用琼脂糖凝胶电泳评估FFPE样本中制备的DNA的片段完整性。

04

自动化电泳法

常用2100 Bioanalyzer对样品进行分离。该方法采用微流控技术，在玻璃芯片上蚀刻若干微米级通道，构建“微型实验室”，当给芯片加入电压时，样品在芯片上的显微蚀刻管道中进行毛细管电泳。

主要原理为DNA双链可嵌入凝胶-染料基质中的荧光染料，利用激光诱导的荧光检测（laser induced fluorescence，LIF）技术，仪器自动检测电泳过程中根据大小被分离的片段，并将其转换成凝胶状图像（条带）和电泳图（峰）。

利用已知片段大小和浓度的Ladder和Marker，生成迁移时间与片段大小的标准曲线，通过样品峰面积对已知浓度的Marker或Ladder面积的比值来对样品的大小和浓度进行定量。

图6. 微流控芯片的工作原理

实验中常用的2100生物分析仪现在已广泛取代了繁琐的凝胶电泳技术成为RNA样品质量控制（QC）的行业标准，同时在DNA 片段分析和蛋白样品SDS-PAGE分析方面也正在迅速取代凝胶电泳技术。目前安捷伦2100生物分析仪有DNA/RNA/蛋白质/细胞分析试剂盒与试剂，NGS实验中如检测DNA，常选择DNA 1000 Kit 或 High Sensitivity DNA Kit 对文库的片段大小进行质控。

图7. 2100生物分析仪及其芯片类型

05

 荧光定量PCR法 

利用qPCR技术对产物定量，是在PCR体系中添加可与DNA结合的荧光染料。游离状态的荧光染料几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。

随PCR循环数增加，PCR产物与染料的结合量增加，荧光信号呈指数增长，而荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。在PCR扩增过程中，扩增产物（荧光信号）达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数称为Ct值，Ct值与起始模板的对数存在线性关系。

市面上常用罗氏的KAPA hgDNA Quantification and QC Kit 评估DNA质量。通过在PCR体系中加入标准品同时扩增，确定标准曲线，从而实现对起始产物浓度进行相对定量。主要针对于人类基因组单拷贝的高度保守区域的不同位点所设计的引物预混液。最小片段所对应的引物用于获得绝对定量的结果，而额外的引物用于获得在DNA样本中可扩增模板量(质量高的DNA片段)的信息，原理如图7。由此所产生的质量分数(即Q-ratios)，可以用于样本产量或对于如FFPE DNA等质量变化很大的样本的工作流程进行调整。除此之外还有应用在各种测序平台对NGS文库进行精确定量KAPA Library Quantification Kits等试剂盒。

图8. hgDNA Quantification and QC assay 原理示意图

核酸各质控方法对比

目前在NGS实验中常用的质控方法如上，不同的检测方法各有其特点及应用场景，选择合适的质控方法对于下游实验的顺利运行具有极其重要的作用。

随着科学技术的不断更新与发展，相信简便的操作、较高的灵敏度、极高的准确性将是核酸检测技术的趋势。

今天的分享就到这里啦，小石头祝愿老师们都能获得满意的实验结果~

参考文献：

[1]核酸定量支持 - 入门 | Thermo Fisher Scientific - CN

[2]RNA/DNA 核酸定量 | Thermo Fisher Scientific - CN

[3]Qubit™ 1X dsDNA HS 检测试剂盒 (thermofisher.cn)

[4]用于样品质量控制的生物分析仪自动化电泳 | 安捷伦 (agilent.com.cn)

[5]KAPA_hgDNA_Quantification_and_QC_Kit_TDS.pdf (roche-diagnostics.cn)

关于燃石医学

燃石医学（纳斯达克代码：BNR）成立于2014年，公司使命为“用科学守护生命之光”，专注于为肿瘤精准医疗提供具有临床价值的二代基因测序（NGS）。公司业务及研发方向主要覆盖：1）基于NGS的肿瘤患病人群检测，6年间，燃石累计检测样本超过18.5万例，在中国拥有最高的市场份额；2）基于NGS的癌症早检，目前已经进入临床验证阶段。燃石医学于2018年7月获国家药品监督管理局（NMPA）颁发的中国肿瘤NGS检测试剂盒第一证，在体外诊断领域具有里程碑式意义。实验室获得广东省临检中心颁发的“高通量测序实验室”技术审核，以及得美国CLIA和CAP实验室质量体系资质认证。公司将继续致力于开发创新可靠的NGS检测产品，推动肿瘤精准医疗领域的发展。