动态调控网络转录调控单细胞

闲庭之雨 2021-11-29

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今天跟大家分享的是发表在Molecular Therapy: Nucleic Acids（IF: 8.886）上的一篇文章，主要是基于T细胞轨迹的动态调控网络解析T细胞状态转换的转录控制，并识别不同过程中的关键调控因子，思路清晰，紧扣T细胞调控的主题，分析深入浅出，是一篇用简单分析方法讲好单细胞故事的优秀典范，非常值得大家学习哦。

Dynamic regulatory networks of T cell trajectory dissect transcriptional control of T cell state transition

T细胞轨迹的动态调控网络解析T细胞状态转换的转录控制

T细胞表现出异质性的功能状态，这与免疫检查点封锁的响应和肿瘤患者的预后相关。然而，T细胞状态转变动态过程的分子调控机制仍然是未知数。基于非小细胞肺癌中T细胞的单细胞转录组数据，研究者结合细胞状态和拟时序分析，提出一个构建动态调控网络的方法，对T细胞功能障碍的过程进行解析，并且识别出不同阶段的候选调控因子（图1）。

图1.流程图

1.构建CD8+ T细胞在肿瘤微环境中的状态转移轨迹

研究者从14例NSCLC患者邻近的正常肺组织(NTC)、肿瘤组织(TTC)或外周血(PTC)中分离出3700个CD8+ T细胞，对所有T细胞进行无监督聚类，最终被标注为不同的状态，包括原始T细胞、中间T细胞、效应T细胞、两组分别被标记为GZMK和ZNF683功能失调前T细胞簇和功能障碍细胞。

为描述不同状态下CD8+ T细胞之间的关系，研究者使用Slingshot算法进行拟时序分析以建立细胞状态之间的轨迹。推断的状态转移轨迹包含两个谱系，分别呈现从原始状态到功能障碍状态和到效应状态的分叉结构(图2A)。两种都起源于naïve状态，在中间态之后分化。然后，功能失调GZMK和功能失调NF683状态依次位于谱系1(即功能失调谱系)，并以功能障失调状态结束(图2B)。相反，谱系2(即效应谱系)直接结束于终端效应状态(图2C)。在个体患者中也观察到这两种谱系，表明T细胞状态转变的轨迹在不同的患者中普遍存在。

对于每个谱系，不同状态的细胞显示出不同的拟时序分布（图2B-C）。此外，naïve状态标记（CCR7、SELL和IL7R)在拟时序早期活跃，而共抑制受体(PDCD1、CTLA4、TIGIT、LAG3、和HAVCR2)在后期活跃(图2D)，证实功能失调谱系的准确性。同样，效应分子GNLY等的表达沿效应拟时序增加，进一步证实沿效应细胞排序的准确性(图2E)。

组织起源状态转变轨迹的投影可以看出在两个世系中存在明显差异(图2F和2G)。为进一步明确起源和轨迹的关系，研究者根据拟时序分析将细胞平均分为10组，并比较其起源/细胞状态组成。在功能失调谱系中，外周血源性幼稚T细胞和中间T细胞在前四组细胞中占主导地位，然后急剧下降(图2H和2J)。同时，来自肿瘤组织和正常组织的功能障碍前T细胞逐渐增多。正常组织源性细胞一直减少至细胞组6。相反，肿瘤浸润T细胞在随后的细胞组中进一步增加并占主导地位。在效应谱系中，血源性原始T细胞和中间T细胞也占主导地位，正常组织源性和肿瘤浸润T细胞随拟时序逐渐增加，对任何组织源性无明显偏倚(图2和2K)。组织分布和细胞状态组成结果表明血液循环的原始T细胞被招募到肿瘤中，持续抗原刺激驱使中间状态细胞向功能障碍前细胞分化，并进一步分化到功能失调状态。另一种谱系从中间状态细胞直接分化为正常效应细胞等。

图2.单细胞分析揭示CD8+ T细胞在肿瘤微环境中的状态转移轨迹

2. 刻画T细胞功能失调特异基因的动态改变

为确定调控T细胞功能失调的基因，研究者首先尝试通过应用tradeSeq算法识别出在功能障碍谱系中发生差异表达的1787个基因（图3 A)。除PDCD1、CTLA4和HAVCR2等共抑制受体外，还识别出许多参与T细胞分化的基因(图3B-3F)，如IFNG等效应分子(图3D)和肿瘤坏死因子 (图3E)的持续增加，表明功能障碍T细胞可能并没有完全失去其抗肿瘤效应潜力。此外，CXCL13等与淋巴细胞迁移相关的基因沿着谱系发生动态表达 (图3F)。

为进一步分析功能失调过程中生物功能的时间关系，研究者进行高分辨率的功能活动分析，结果表明与细胞转换相关的信号通路在幼稚期高度活跃，并从中间活跃期开始迅速下降(图3G)。细胞毒性功能继续上调，并在最近的功能失调阶段达到最高活性(图3H)。然而，T细胞活化和细胞迁移的活性在功能障碍前期达到顶峰，然后在后续阶段略有下降(图3I)。基因表达的动态分析揭示T细胞功能失调过程的分子动态变化。

图3.功能失调谱系的动态基因分析

3. T细胞功能失调过程的动态网络构建

功能失调过程中T细胞的状态转变受转录调控因子（TFs）及其相关辅助因子的控制。为更好地理解驱动T细胞功能调控的分子机制，研究者提出一个动态调控网络构建的方法，用可变长度滑动窗口的方法来分割细胞。基于细胞状态的拟时序分布，研究者将功能失调细胞谱系划分为四个重叠窗口，每个窗口主要由两个连续状态的细胞组成。例如，窗口1 (W1)主要由幼稚态和中间态细胞组成，而W2主要由中间态和失调前GZMK态细胞组成(图4A)。每个窗口分别构建基因调控网络(GRNs)，反映控制两状态间过渡的调控环节。最终，在至少一个网络中推断出82个调控因子和1641个靶点之间的7117个相互作用(图4A)，每个调控因子的大小从1到229个基因不等。W1、W2和W3具有相似的节点和互作数量，而最后一个窗口的网络W4包含相对较少的节点(1,143)和较少的交互(1,886)。

研究者进一步基于本工作中的方法在另外8个单细胞RNA测序数据集中构建动态网络。在不同数据集的每个状态转换过程中识别的调控因子有很高的重叠(图4B)。

为阐明本动态网络构建方法的优点，研究者对所有功能失调的细胞在没有窗口细胞的情况下实行GENIE3算法，结果表明未打开窗口识别的TFs与本方法的靶点基因存在重叠(图4C)，表明使用所有细胞构建的GRN_all可以捕获整个谱系中的某些信息。然而，GRN_all可能偏向于大细胞亚群，丢失来自其他细胞的一些信息。GRN_all与W3中的靶基因交叠程度最高(图4C)，说明受到W3信息偏倚的影响。此外，窗口滑动方法可以进一步TF发挥作用的阶段进行分析。例如，研究者在GRN_all中识别出50个TOX靶基因，其中30个靶基因与W4中鉴定的靶基因相同，表明TOX可能更多是在W4中发挥作用 (图4C)。

研究者选择晚期功能失调窗口W4，评估不同GRN构建算法的影响，其中GENIE3方法的准确性最高，故本工作选择GENIE3方法（图4D）。

图4.功能失调谱系相关动态网络的构建和验证

4. 大量的调控重连控制细胞状态转变

为详细阐述T细胞功能失调过程中调控作用的动态变化，研究者系统地比较不同转变过程中的调控网络。在不同网络之间存在大量的节点重叠，其中44.4%存在于所有四个网络中(图5A)，而TFs的重叠率更高(63.4%)(图5B)。然而，通过检查四个网络的边缘重叠，研究者发现在每个窗口中都有大量特异性的边(图5C)。基于Jaccard指数(JI)评估任意两个网络中TF调控靶点的重叠。两个连续窗口(W1_W2、W2_W3、W3_W4)之间的平均JI值分别为0.11、0.14和0.12(图5D)，表明TFs沿着T细胞轨迹基本上重新连接到不同的靶点(即重连)。PRDM1在第一个窗口中上调，并在随后的状态中持续表达(图4B-4E)。然而，PRDM1在不同窗口中调控特定的基因，并参与窗口特异性功能。例如，PRDM1在W1中发挥了干扰素相关功能，而在 W3和W4的T细胞激活和去磷酸化中发挥作用(图5E)。此外，ID2也在四个网络之间重新连接，进而发挥不同作用(图5F)。

T细胞耗竭表现为共抑制分子的高表达。研究者提取每个窗口的共抑制受体亚网络，以研究共抑制因子的调节重连(图5G)。共抑制受体的动态重连表明，在T细胞功能失调过程中，共抑制受体受到不同转录因子的调控，进而形成一个激活级联。

图5. T细胞功能失调过程中的大规模网络重连

5．解析TFs的动态重组模式

状态转换网络中存在大量的特定边，在相应窗口中调控对的相关性最高(图6A)，此外相关性在各个窗口中逐渐变化。在状态转换过程中，窗口间的调控相互作用的波动和重新连接表明，转录因子可能在某些阶段发挥主导调控作用。如果某特定窗口中转录因子的靶点数量高于所有窗口平均数量，则研究者认为该转录因子在该窗口和过程中发挥主导调控作用。最终研究者获得11种调控模式，包括4种窗口特异性调控模式和7种持续性调控模式(图6B-C)。

为探究TFs的协同效应，研究者基于Simpson指数估计每个窗口中TFs之间的调控相似性，分别识别出W1和W2的两个模块，W3和W4的一个模块(图6D-G)。同一模块中的TF倾向于具有相同的调控模式，比如W1中的M1模块包含TCF7、LEF1、MYC、SATB1和BACH2，除TCF7外，其余均在W1中起主导作用(图5D)。W2中的M2含有W2特异性调控因子ZBTB38、EOMES和ZEB2(图6E)，在细胞杀伤和白细胞活化中参与免疫应答。W3中的M1包含W3特异性调控因子HOPX、ZNF683和ID2，以及两个持续的调控因子，仅调控少量靶点(图6F)，涉及免疫系统中细胞因子信号转导等。W4中的M1含有TOX、ETV1和RBPJ，它们在W4中起主导作用(图6G)，在淋巴细胞活化和T细胞共刺激中富集。

图6. 转录因子的动态调控模式

6. 关键调节因子导致T细胞功能失调

为进一步衡量状态转移网络中不同特征因子的重要性，研究者结合度、贴近度等建立一个综合的中心性度量。图7A-D显示四个状态转换网络中中心度指标最高的前10个TFs。这组关键的TFs包括TCF7等已知的介导T细胞状态转变的调控因子。此外，TSC22D3 在W2、W3和W4中持续发挥调控作用(图6C)，在三个窗口中都是最重要的调控因子之一(图7B-D)。虽然TSC22D3在不同的窗口中调控不同的靶点(图7E)，但它可以随着时间的推移不断调节某些生物学功能 (图7F)。研究者观察到TSC22D3在W2中特异性调控细胞对生物刺激的反应，在W3中特异性调控T细胞增殖(图7F)。

沿着细胞状态转换，研究者发现TSC22D3的表达先升高后降低，在功能障碍前状态表达最高(图6G)。在另外三套scRNA-seq数据集中，研究者同样观察到TSC22D3在功能障碍前状态下的表达始终显著高于功能障碍状态下的表达 (图7H和7I)，表明其在T细胞功能障碍前的关键作用。基于GEO的两组NSCLC患者，研究者发现TSC22D3的高表达与总生存期显著相关(图7K和7L)。以上结果表明，TSC22D3可作为T细胞功能障碍前的关键调节因子，并与NSCLC患者的临床结局相关。