nusG基因与具核梭杆菌的关系

本发明涉及生物
技术领域：
，具体而言，涉及一种用于real-timepcr检测具核梭杆菌的引物组、产品及检测方法与应用。
背景技术：
：具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum，f.nucleatum)是一种革兰氏阴性短杆菌，通常在口腔中普遍存在，与牙周炎的发病有关，并且与宫内感染、新生儿败血症、早产和阑尾炎等疾病相关。近年来越来越多的研究证实，具核梭杆菌在crc病人的组织和粪便中富集并和crc的发生、发展和预后有着密切的关系。结直肠癌(colorectalcancer，crc)是一种最常见的恶性肿瘤之一，在男性中排名第三，在女性中排名第二，近几十年来crc的发生率呈不断上升的趋势。晚期crc病人的5年生存率极低，早期crc病人接受治疗后的5年生存率可达72％-100％，因此，对于crc早期诊断至关重要。目前常用的crc辅助诊断方法大体可分为可视化检查(结肠镜检查、ct肠造影检查、钡剂双对比造影检查、乙状结肠镜检查)和粪便检测(粪便免疫检测fit、高灵敏度愈创木聚糖粪便潜血试验gfobt、粪便免疫联合脱落物dna检测)，但这些辅助诊断方法都存在有创或灵敏度低等问题。现常用的检测具核梭杆菌的方法有：细菌分离培养、血清学检测、免疫组织化学检测、宏基因组测序技术、聚合酶链式反应(pcr)等。但具核梭杆菌分离培养条件要求高、时间周期长且受组织和粪便中其他复杂因素影响大，临床分离鉴定不易执行。血清学检测和免疫组织化学检测灵敏度低，宏基因组测序对设备和技术要求高、成本高且耗时长，不适用于普通实验室和临床标本的检测，且这些方法都不能对具核梭杆菌进行定量检测。数字pcr检测需要特定的设备和条件，费用高昂，同样不适用于普通实验室和临床标本的检测。探针法实时定量荧光pcr技术需要合成荧光探针，成本较高。环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)灵敏度较高，但容易受气溶胶污染，加上目前国内大多数实验室不能严格分区，假阳性问题比较严重。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：针对现在临床标本中具核梭杆菌的分离培养较为困难且时间周期长，血清学检测和免疫组织化学检测灵敏度低，宏基因组测序和数字pcr检测对检测设备和技术要求高且成本高，lamp检测假阳性率高，探针法实时定量荧光pcr成本较高，均不能较好的满足临床需求的现状，本发明提供了用于real-timepcr(实时荧光定量pcr)检测具核梭杆菌的引物组、产品及检测方法。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：用于real-timepcr检测具核梭杆菌的引物组，所述引物组包括：上游引物nusg-1f如seqidno.1所示：5’-gcttgaattggaagctagaagaga-3’；第一下游引物nusg-1r如seqidno.2所示：5’-gggtcagaacgaactcctacaa-3’；第二下游引物nusg-2r如seqidno.3所示：5’-ggatctgatcgaactcctacaa-3’。上述引物组在real-timepcr检测具核梭杆菌或制备real-timepcr检测具核梭杆菌的产品中应用。进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒。一种试剂，包括上述引物组。一种试剂盒，包括上述引物组或试剂。进一步地，还包括2×tbgreenmix和无核酸酶水。一种具核酸杆菌的检测方法，以待检测样品基因组dna为模板，上述引物组为引物进行real-timepcr，若出现荧光信号则可判定待检测样品中存在具核梭杆菌。进一步地，利用检测出具核梭杆菌的待检测样品的ct值与标准曲线进行对比计算，定量得到待检测样品中具核梭杆菌的数量；所述标准曲线为具核梭杆菌标准品数量与ct值的关系曲线。进一步地，所述标准曲线的建立包括：等倍稀释已确定浓度的具核梭杆菌标准品，以稀释得到的各浓度的具核梭杆菌标准品为模板，以上述引物组为引物进行real-timepcr，得到各浓度的具核梭杆菌标准品对应ct值，得到标准曲线；优选地，所述具核梭杆菌标准品包括具核梭杆菌菌株或含有nusg基因的阳性质粒。进一步地，引物浓度为300nm-600nm；优选地，real-timepcr的程序中退火温度为52-59℃。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)特异性强：本发明提供的引物组是根据具核梭杆菌基因组序列内的高度保守的nusg基因序列设计，得到的对具核梭杆菌具有特异扩增作用的real-timepcr引物。研究证实，利用该引物组对具核梭杆菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、白色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、伤寒杆菌、变形链球菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、甲型溶血性链球菌、绿脓杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌进行检测，只在具核梭杆菌全基因组dna中有扩增曲线，说明本发明所设计的引物组特异性强，用于检测具核梭杆菌准确可靠；(2)灵敏度高：本发明提供的引物组在进行real-timepcr分析时，对具核梭杆菌的检测灵敏度可高达100cfu；(3)防止漏检：本发明提供的引物组包括3条引物，能有效的防止漏检；(4)实用性强：本发明的引物组，不仅能对纯培养的具核梭杆菌进行检测，也能对临床标本中的具核梭杆菌进行检测，与lamp法相比，可实现临床标本中具核梭杆菌的准确快速检测，假阳性率低，在结直肠癌的筛查和临床辅助诊疗中有一定的应用价值；(5)检测成本低：本发明提供的引物组和具核梭杆菌的检测方法为染料法real-timepcr，检测成本较现有宏基因组测序、数字pcr和探针法real-timepcr低，更适用现场快速检测，为具核梭杆菌的非疾病诊断目的的鉴定检测提供简便方法，避免了分离培养鉴定的繁琐操作，缩短了鉴定时间，保证检测效果的同时降低了检测成本。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例1中不同引物扩增曲线图；图2为实施例2中引物组对具核梭杆菌进行实时荧光定量pcr在不同退火温度下的扩增图；图3为实施例3中引物组的引物浓度为400nm的荧光定量pcr的扩增图；图4为实施例4中引物组特异性的检测结果图；图5为实施例5中标准品线性试验结果图；图6为实施例5中标准曲线图；图7为实施例6中roc曲线。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。用于real-timepcr检测具核梭杆菌的引物组，包括：上游引物nusg-1f如seqidno.1所示：5’-gcttgaattggaagctagaagaga-3’；第一下游引物nusg-1r如seqidno.2所示：5’-gggtcagaacgaactcctacaa-3’；第二下游引物nusg-2r如seqidno.3所示：5’-ggatctgatcgaactcctacaa-3’。pcr是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制，pcr的最大特点，是能将微量的dna大幅增加。其基本原理类似于dna的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。pcr由“变性-退火-延伸”三个基本反应步骤构成，每完成一个循环需2-4分钟，重复循环“变性-退火-延伸”过程2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。因此，只要分离提取微量dna，就能用pcr加以放大，进行比对。实时荧光定量pcr(real-timepcr)，是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，实现定性，又可以通过标准曲线对未知模板进行定量。本发明提供的引物组是根据具核梭杆菌基因组序列内的高度保守的nusg基因序列设计，得到的对具核梭杆菌具有特异扩增作用的real-timepcr引物。研究证实，利用该引物组对具核梭杆菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、白色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、伤寒杆菌、变形链球菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、甲型溶血性链球菌、绿脓杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌进行检测，只在具核梭杆菌全基因组dna中有扩增曲线，说明本发明所设计的引物组特异性强，用于检测具核梭杆菌准确可靠；本发明提供的引物组在进行real-timepcr分析时，对具核梭杆菌的检测灵敏度可高达100cfu；本发明提供的引物组包括3条引物，能有效的防止漏检。需要说明的是，引物是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条dna模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条dna模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3’端开始合成新的核酸链。在本发明中，提供的引物组中3条引物均可与目的基因序列结合，完成pcr扩增反应。上述引物组在real-timepcr检测具核梭杆菌或制备real-timepcr检测具核梭杆菌的产品中应用。在一些实施方式中，产品包括试剂或试剂盒。一种试剂，包括本发明提供的引物组。一种试剂盒，包括本发明提供的引物组或试剂。在一些实施方式中，试剂盒还包括2×tbgreenmix和无核酸酶水。一种具核酸杆菌的检测方法，以待检测样品基因组dna为模板，本发明提供的引物组为引物进行real-timepcr，若出现荧光信号则可判定待检测样品中存在具核梭杆菌。在pcr反应体系中，加入sybr荧光染料，sybr荧光染料特异性地掺入dna双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的sybr染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步。本发明提供的检测方法可以实现快速检测，假阳性率低，成本低，适用于现场快速检测，为具核梭杆菌的非疾病诊断目的的鉴定检测提供简便方法，避免了分离培养鉴定的繁琐操作，缩短了鉴定时间，保证检测效果的同时降低了检测成本。在优选的实施方式中，引物的浓度为300nm-600nm，需要说明的是，这里的引物浓度是指上游引物nusg-1f的浓度为300nm-600nm，第一下游引物nusg-1r和第二下游引物nusg-2r的总浓度为300nm-600nm，其中，第一下游引物nusg-1r和第二下游引物nusg-2r的比例为1:1。当引物浓度为上述浓度时，real-timepcr的扩增能更加顺利的进行，得到优质的结果。在优选地实施方式中，real-timepcr的扩增程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性10秒，52-59℃退火10秒，72℃延伸20秒，进行40个循环。退火温度可以进一步优选为57℃。最后，在荧光检测仪上检测相应的荧光信号，得到检测结果。在优选地实施方式中，利用检测出具核梭杆菌的待检测样品的ct值与标准曲线进行对比计算，定量得到待检测样品中具核梭杆菌的数量，其中，标准曲线为具核梭杆菌标准品数量与ct值的关系曲线。通过标准曲线，可以快速得到待检测样品中的具核梭杆菌数量，实现定量检测。在优选地实施方式中，标准曲线的建立包括：等倍稀释已确定浓度的具核梭杆菌标准品，以稀释得到的各浓度的具核梭杆菌标准品为模板，以本发明提供的引物组为引物进行real-timepcr，得到各浓度的具核梭杆菌标准品对应ct值，得到标准曲线，其中，具核梭杆菌标准品优选为具核梭杆菌菌株或含有nusg基因的阳性质粒。在进一步优选地实施方式中，标准曲线的具体建立包括：用200μl无酶水稀释溶解含有nusg基因的阳性质粒，然后用无酶水以1:10的梯度将样本进行系列稀释，选取稀释倍数为103-108的质粒，用国际标准品对阳性质粒进行准确定量。然后选取已确定浓度的阳性质粒，用无酶水以1：10的梯度将样本进行系列稀释，以各浓度的稀释样本作为dna模板，进行实时荧光定量pcr反应，扩增程序95℃预变性30秒，95℃变性10秒，57℃退火10秒，72℃延伸20秒，共40个循环，72℃终延伸2min，于72℃时测定荧光值，每个循环反应结束后收集并记录荧光信号，以各梯度浓度对应的质粒质量对数值作为纵坐标，ct值为横坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线(nusg基因在具核梭杆菌基因序列中拷贝数为1)。在优选地实施方式中，待检测样品包括粪便或组织，组织是指结直肠的黏膜组织。下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。实施例1本实施例引物组包括：引物组1：上游引物nusg-1f如seqidno.1所示：5’-gcttgaattggaagctagaagaga-3’；第一下游引物nusg-1r如seqidno.2所示：5’-gggtcagaacgaactcctacaa-3’；第二下游引物nusg-2r如seqidno.3所示：5’-ggatctgatcgaactcctacaa-3’；引物组2：上游上游引物nusg-2f如seqidno.4所示：5’-gaggaaagcccaagaaggtct-3’；下游引物nusg-2f如seqidno.5所示：5’-gggtcagaaccaactcctaca-3’；引物组3：上游引物nusg-3f如seqidno.6所示：5’-agaggaaagcccaagaaggtc-3’；下游引物nusg-3f如seqidno.7所示：5’-agggtcagaaccaactcctac-3’；本实施例应用本发明提供用于real-timepcr检测具核梭杆菌的最佳引物组验证。引物序列委托上海生工生物工程有限公司合成。复苏培养具核梭杆菌，提取具核梭杆菌基因组dna，以具核梭杆菌基因组dna为模板进行pcr，pcr反应体系(20μl)如下：2×tbgreenmix10μl、无核酸酶水4.4μl、上游引物0.8μl、下游引物0.8μl(其中引物1的两个下游引物分别为0.4μl)、dna模板4μl；在荧光定量pcr仪上扩增，扩增反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s，在55℃退火10s，72℃延伸20s，共40个循环，72℃终延伸2min，于72℃时测定荧光值，每个循环结束后收集并记录荧光信号，比较不同退火温度下的扩增效率，结果如附图1，有结果可知，引物组1扩增曲线的ct值较引物2和引物3小，故选择引物组1为最终的引物组合。实施例2用于real-timepcr检测具核梭杆菌的引物组包括：上游引物nusg-1f如seqidno.1所示：5’-gcttgaattggaagctagaagaga-3’；第一下游引物nusg-1r如seqidno.2所示：5’-gggtcagaacgaactcctacaa-3’；第二下游引物nusg-2r如seqidno.3所示：5’-ggatctgatcgaactcctacaa-3’。本实施例应用本发明提供用于real-timepcr检测具核梭杆菌的引物组对具核梭杆菌进行实时荧光定量pcr扩增的退火温度的验证。根据具核梭杆菌特异性基因nusg(nc_003454.1:c549749-549168)设计引物，引物序列委托上海生工生物工程有限公司合成。复苏培养具核梭杆菌，提取具核梭杆菌基因组dna，以具核梭杆菌基因组dna为模板进行pcr，pcr反应体系(20μl)如下：2×tbgreenmix10μl、无核酸酶水4.4μl、上游引物0.8μl、下游引物0.8μl(其中引物1的两个下游引物分别为0.4μl)、dna模板4μl；在荧光定量pcr仪上扩增，扩增反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s，分别在52.5℃、53.4℃、54.8℃、56.5℃、57.8℃、58.6℃、59℃退火10s，72℃延伸20s，共40个循环，72℃终延伸2min，于72℃时测定荧光值，每个循环结束后收集并记录荧光信号，比较不同退火温度下的扩增效率，结果如附图2，由结果可知，当pcr的退火温度为52℃-57℃引物的扩增效果均较好，阴性对照没有荧光信号，综合考虑ct值大小，s型曲线的典型程度以及平滑度，将其最适退火温度设定为57℃。实施例3本实施例应用本发明提供的引物组，利用不同浓度的引物组对具核梭杆菌进行real-timepcr扩增的引物浓度的验证。1.本实施例按照实施例2提供的方法在下列不同浓度引物组中进行real-timepcr扩增实验。引物组浓度如下表1所示(备注：引物浓度100nm指上游引物浓度100nm，两种下游引物的和与上游引物相同为100nm，第一下游引物和第二下游引物的比例为1:1)。表1引物组浓度引物浓度100nm200nm300nm400nm500nm600nm800nm2.实验结果如下表2所示：表2real-timepcr结果当反应体系中引物浓度为400nm时，ct值小且曲线呈现光滑的s型，结果如图3所示，所以选择引物浓度400nm最佳引物浓度。实施例4本实施例提供了本发明提供的引物组的特异性的验证。根据具核梭杆菌特异性基因nusg(nc_003454.1:c549749-549168)设计引物，将引物序列在ncbi基因库中进行primer-blast比对，结果显示其仅在具核梭杆菌属中有扩增片段，大小为128bp。将具核梭杆菌(实验组)，粪肠球菌、肺炎链球菌、白色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、伤寒杆菌、变形链球菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、甲型溶血性链球菌、绿脓杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌(对照组)分别复苏培养，提取各细菌全基因组dna，采用紫外分光光度计检测dna纯度和质量浓度。以上述各细菌的基因组dna为模板进行pcr，以检测引物的特异性，pcr反应体系和扩增条件同实施例2。结果如表3和图4所示，引物只在以具核梭杆菌基因组dna为模板的pcr扩增中有扩增曲线显示，可初步认定本实验设计的引物特异性良好，能特异性的鉴定具核梭杆菌。表3特异性检测结果样品ct值空白对照无阴性对照无阳性对照21.05粪肠球菌无肺炎链球菌无白葡萄球菌无乙型溶血性链球菌无伤寒杆菌无变形链球菌无痢疾杆菌无枯草杆菌无金黄色葡萄球菌无大肠杆菌无甲型溶血性链球菌无绿脓杆菌无双歧杆菌无嗜酸乳杆菌无实施例5本实施例对实施例2提供的用于检测具核梭杆菌的引物组进行标准曲线的验证。1.标准曲线实验方法合成puc57-nusg阳性质粒，用200μl无酶水稀释溶解阳性质粒，然后用无酶水以1:10的梯度将样本进行系列稀释，选取稀释倍数为103-1010的质粒，用国际标准品humandnaquantitationstandard对阳性质粒进行准确定量。然后选取已确定浓度的阳性质粒，用无酶水以1：10的梯度将样本进行系列稀释，以各浓度的稀释样本作为dna模板，采用实施例2提供的实验方法进行实时荧光定量pcr。2.标准曲线实验结果表4为质粒dna实际测定每μl中拷贝数与对应的ct值均值。表4标准曲线点值检测结果质粒dna实际测定每μl中拷贝数ct值均值1.31×10-1n/a1.31×10036.631.31×10134.031.31×10230.901.31×10327.191.31×10423.761.31×10519.931.31×10616.64标准曲线的线性范围的实验结果如图5所示，标准曲线的线性范围为：1.31×101拷贝/μl-1.31×106拷贝/μl。图6为dna标准曲线，可以看出dna标准品浓度在线性范围内的各点ct值间的间距相等，且以ct值为纵坐标，样本浓度为横坐标所作的标准曲线r2>0.99，扩增效率e为90％-110％。实施例6本实施例对实施例2提供的用于检测具核梭杆菌的引物组进行roc曲线的验证。样本制备样本1：选取正常粪便样本20例(200mg)，试剂盒提取模板dna；样本2：分别在各组粪便(200mg)中(每组20例)加入50cfu、102cfu、103cfu、104cfu、105cfu的具核梭杆菌液，试剂盒提取模板dna；按照实施例2中的方法进行实时荧光定量pcr检测，分析数据。然后将实时荧光定量分析所得ct值带入spss软件，制备roc曲线，roc曲线如图7所示，roc曲线实验结果如下表所示，阴性对照无实时荧光定量pcr扩增曲线。结果如下：auc(areaunderroc)为0.955，spss软件分析各样本ct值可知，youden指数最大为0.650，最大youden指数对应的ct值37.02即为阳性判定临界值。实施例7本实施例对实施例2提供的用于检测具核梭杆菌的引物组进行精密度的验证。首先，取弱阳性样本(ct值在30-33间)，采用实施例2提供的实验方法进行实时荧光定量pcr扩增实验，批内重复至少10个样本，至少重复3次实验。实验结果如下表5所示：同一样本复孔ct值的变异系数(cv％)小于5.0％。变异系数无异常，精密度良好，实验的准确度高。表5精密度检测实施例8本实施例对实施例2提供的用于检测具核梭杆菌的引物组进行灵敏度验证。1.实验方法在正常粪便中加入1×102cfu的具核梭杆菌菌液作为模拟样本，提取样本基因组dna，用实施例2中的方法对核酸样本进行实时荧光定量pcr分析。2.实验结果如下表6所示。表6灵敏度检测重复次数ct值均值重复次数ct值均值134.681134.82234.421234.57334.811334.18434.911434.48534.831534.81634.981634.57734.971734.66834.521834.59934.481934.671034.522034.76由上表6所示，最低检测线为100cfu/200mg，最低检测限的ct值小于35，重复20次实验检出率为100％，故本发明提供的用于检测具核梭杆菌的核酸组合用于实时荧光定量pcr检测具核梭杆菌具有很高的灵敏性。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。sequencelisting<110>重庆博利达医学科技有限公司<120>用于real-timepcr检测具核梭杆菌的引物组、产品及检测方法与应用<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<400>1gcttgaattggaagctagaagaga24<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2gggtcagaacgaactcctacaa22<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3ggatctgatcgaactcctacaa22<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4gaggaaagcccaagaaggtct21<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5gggtcagaaccaactcctaca21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<400>6agaggaaagcccaagaaggtc21<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7agggtcagaaccaactcctac21当前第1页12