【原】记一次紧张害怕转危为安的测序实验

我以前一直以为illumina的下机数据就是按照barcode分好样的fastq文件

（关于fastq文件可以查看前贴FastQC 你需要知道的在这里！）

可是一次实验室惨案让我意外的发现，竟然不是呢！

故事是这样的，上个月笔者经历了一次非常艰苦的测序过程，熬了个通宵千辛万苦好不容易才成功建库的呢。眼看着上机后Q30比例和cluster都很完美，笔者就放心的回去休息了，可一觉醒来下机后我竟然愕然发现上机的6个样本的fastq测序文件大小竟然为0！这怎么可能，测序通量和产出明明都很正常的啊。

经过一番紧张细致的排查后，笔者才发现，原来是所有的序列都被分到了Undetermined文件里了（注：其于illumina测序仪中用于存放未能被正确分样的序列文件）。

再进一步回查上机文件（Samplesheet.txt）笔者才发现，

原来是上机设置中的barcode序列(index)输错啦！！我晕，这种低级错误也能出现，笔者不知道要该自罚多少个鸡腿才好了。

问题是发现了，可是该怎么解决呢？ 现在上机的6个样本序列像一锅粥一样完全都混在了一起，不能区分了呢。

感谢illumina工程师的电话支持解惑，我才知道：

原来！illumina的下机文件不是fastq，而是bcl格式文件（per-cycle BCL basecall file）。我们看到的fastq文件事实上是测序仪自带电脑里的bcl2fastq软件按照上机时设置的samplesheet进行的转换和拆分后生成的呢。

所以！发生barcode错误设置问题后，我们可以修正samplesheet文件后利用bcl2fastq程序重新运行拆分操作，得到正确的测序fastq文件。

具体操作方法如下：

1、安装bcl2fastq程序

程序的安装包可通过illumina官网下载：

https://support./sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software.html

也可以通过github下载：

https://github.com/brwnj/bcl2fastq

安装方法也比较简单，如下载的源码，可以通过以下命令安装：

python setup.py install

如下载的rpm包，则可以通过以下命令安装

yum install -y your.rpm

2、准备输入文件

将需要重新拆分的illumina下机文件中的Data文件夹（包含了所有的bcl文件）复制黏贴到新的路径下，同时将该轮上机产生的RunInfo,Runparameter以及samplesheet文件放置到和Data文件夹相同的路径下。注意samplesheet文件是修正过的哦~

3、运行bcl2fastq重新拆分和生成fastq文件

bcl2fastq --runfolder Data复制后所在路径

一番紧张的操作后，bingo~我的测序数据回来啦！6个样本的数据清清楚楚的列出来啦~一切恢复正常

虽说是转危为安，可是过程实在太紧张了，希望以后不会再有这样的事情发生了~ 阿弥陀佛

PS：意外的发现，bcl2fastq还有两个好的功能点：

功能点1：我们可以自行调整分样时对index的容忍度，比如可以兼容1个或多个位点的错误。相关参数可通过--barcode-mismatches调整。

功能点2：利用bcl2fastq拆分可对undetermined文件中的序列列出其barcode情况，这些信息可以协助我们排查其未能正确划分的原因。

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