【原】新型单细胞 mRNA 和蛋白质表达谱可识别 MDS 患者骨髓中不同的 Treg 和 T 效应子特征

优宁维 2021-12-15

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调节性T细胞(treg)是一种非冗余的、抑制性的CD4+T细胞群体，对预防人类自身免疫性疾病至关重要。它们也可能有助于恶性肿瘤的整体免疫抑制，并防止对恶性细胞的有效免疫监测。

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有资料显示treg数量的增加与高风险MDS之间的相关性。效应T细胞(Teff)的扩张也意味着低风险疾病。通过深度表型分析和自动聚类，已经确定了具有不同功能特性的新treg群体，包括一个表达cd161的亚群。本研究的目的是更深入地询问Treg和Teff亚群，并确定MDS患者骨髓(BM)和外周血(PB)中Treg和Teff的转录组谱，以及PB和BM驻留细胞之间的潜在差异。

实验流程：
1、采集自高风险和低风险患者的PB和BM。

2、对这些样本进行CD4+T细胞进行磁性富集，然后对treg(CD4+、CD25high、CD127low)和Teff(CD4+、CD25low和CD127high)进行流式分选。

3、共有8个细胞组分用于下游scRNAseq，并使用BD Rhapsody单细胞分析系统进行蛋白表达谱分析。

4、用oligo标记抗体(CD95、CD45RO、CD38、CTLA-4、PD-1、HLADR)和样本标签标记细胞部分。

5、标记后，将所有样本结合起来，进行单细胞捕获和带有标记的磁性微珠上的mRNA转录本的分子索引。

6、微珠检索和微珠上cDNA合成后，生成平行靶向mRNA和Abseq测序文库。

UMAP的分析能够根据Treg和Teff特征明确地分离高风险和低风险患者，而在PB中并非如此。

a)来自 BM 和 PB、高危和低危 MDS 患者的 Treg；
b)来自 BM 和 PB、高风险和低风险 MDS 患者的 Teff。

CD95、CD45RO、CD38、CTLA-4、PD-1、HLA-DR在高危和低危MDS患者BM中的表达水平。

在蛋白水平上，来自高危患者的BMTreg显著表达CD95、CD45RO、CTLA4 、PD-1
和CD38(图1c)，表明Treg功能更高。转录组的GSVA分析显示，高风险和低风险患者在treg和Teffs之间均有显著变化。

具体来说，来自高危MDS的treg与非TCR介导的激活途径更富集，包括白细胞分化、Jak-STAT信号和白细胞粘附的正调控。

对 Treg 的更深入研究表明，在高风险和低风险患者的骨髓中，特别是分泌 IL-17 的 CD161+Treg 和维持造血干细胞静止的 CD150+ Treg含量较低。

本文为同时进行单细胞转录组学和蛋白表达来识别高风险和低风险MDS中不同的BM特异性T细胞特征的能力提供了证据。来自高危MDS BM的treg显示出更高的treg相关蛋白的表达，并且在非TCR特异性激活通路中更富集，这可能反映了骨髓来源的炎症环境。总的来说，这些发现表明在MDS中存在骨髓特异性的Treg特征，并且可以区分低风险和高危疾病。

MDS：骨髓增生异常；BM：骨髓；PB：外周血

BD RhapsodyTM单细胞测序系统介绍

BD Rhapsody 系统基于BD 在细胞生物学领域40年的专业技术，克服了传统检测的局限性，能够对成千上万个单细胞的数千个表达基因同时进行数字定量，每个细胞提取独立数据，体现异质性，可以鉴定和表征新型和罕见细胞类型，有助于理解从免疫学到肿瘤学等多个领域内的生物学过程。
1、BD Rhapsody 核心技术之微孔板

一个微孔 = 一个单细胞 + 一个磁珠

BD Rhapsody

Express单细胞分析系统提供的单细胞分割，以微孔为基础，功能强大。

最低限度一套台式设备，没有射流泵
当细胞在重力作用下沉入微孔时，可以对其进行温和的处理
每个BD Rhapsody微孔板均包括一个超过22万个分区的微孔阵列
BD Rhapsody"微孔板体积约为600μL，稀释细胞悬浮液可直接装入微孔板，无需将其浓缩到非常小的体积
由于没有微流通道，因此细胞堵塞通道的问题并不严重
微孔经过特殊处理，以防止细胞粘附在表面，并进行深入的质量控制

Rhapsody利用微孔进行单细胞分离，属于Microwell-seq。

20万个微孔的尺寸被设计成一个微孔恰好可以容纳一个bead+一个细胞。

2、BD Rhapsody核心技术之Barcoded Bead

3、单细胞文库制备及测序

BD Rhapsody产品线overview

Reference:Novel Simultaneous Single Cell mRNA and Protein Expression Profiling Identifies Distinct Treg and T Effector Signatures in the Bone Marrow of MDS Patients.