基于网络药理学和分子对接的文殊兰抗肿瘤作用机制研究

摘  要：目的  运用网络药理学筛选文殊兰的主要活性成分及其靶点，探究文殊兰抗肿瘤的潜在作用机制。方法  通过TCMID数据库检索文殊兰的化学成分，再经Batman与Swisstargets并结合相关文献筛选出文殊兰的主要活性成分及其潜在靶点”网络可视化关系图；以蛋白互作网络分析数据库，确立文殊兰和肿瘤的蛋白互作网络；利用基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes，KEGG）数据库对相关靶点进行富集分析，了解文殊兰抗肿瘤可能的生物过程及其通路；利用分子对接进行半柔性对接反向验证。结果  从文殊兰中筛选出15种活性成分，与肿瘤有关的通路有25个，文殊兰抗肿瘤主要作用于INS、GAPDH、VEGFA、EGFR、TNF等靶蛋白，KEGG通路富集结果显示，文殊兰主要作用于prostate cancer、proteoglycans incancer、microRNAs in cancer、viral carcinogenesis等信号通路。结论  文殊兰可能对前列腺癌、非小细胞癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌等具有一定的治疗作用，诱导肿瘤细胞凋亡是文殊兰成分抗肿瘤的一个重要机制。初步推测并验证了文殊兰抗肿瘤的主要靶基因和通路，为后续进一步探讨文殊兰靶向抑制肿瘤细胞提供新思路。

文殊兰Crinum asiaticum L.为石蒜科文殊兰属植物，全植株含有生物碱、黄酮、氨基酸类等多种化学成分^[1]。《本草纲目拾遗》中记载文殊兰：“叶似带，治折伤损手足者，取叶火煨热，贴之即愈。”其民间以叶和根状茎入药，能够祛火解毒、消肿散结^[2]。文殊兰有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、镇痛、抗过敏、保护心血管系统、抗拟胆碱样等药理作用^[3-4]。文殊兰鳞茎中含有石蒜碱、恩其明、力克拉敏等多种生物碱^[5]，是其主要的抗肿瘤活性成分。

肿瘤是危害当今人类健康的重要杀手，近年来，随着肿瘤研究的发展，临床抗肿瘤药物的耐药性和化疗后副作用等一系列问题的出现，抗癌中药的筛选始终是研究热点^[6]。大量研究表明，文殊兰中的石蒜碱可通过抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用^[7-9]，但对文殊兰中其他成分的相关报道很少，因此，本研究应用网络药理学研究文殊兰抗肿瘤的活性成分，以期为该药的深入研究提供理论基础。

1  材料与实验

1.1  靶点筛选

1.2 蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction，PPI）构建

将药物疾病交集靶点输入String数据库（https:///cgi/input.pl）构建PPI网络进行初步筛选，再将PPI网络导入Cytoscape 3.6.3中，通过Network Analyzer工具进行拓扑分析，以度（degree）、中心度（betweenness centrality）、平均最短路径变化量（average shortest pathlength）和接近中心性（closeness centrality）4个参数为参考标准，通过degree排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶点。以关键靶点作为节点构建相互作用网络，并对前20个靶点进行拓扑分析。

1.3 GO通路富集

1.4 KEGG通路富集及分析

将药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，引用String数据库，将校正P≤0.05的项目进行筛选，并使用R3.6.3软件，安装并引用clusterProfiler包后，绘制与癌症相关的相关通路气泡图。将文殊兰预测得到的化合物与癌症相关的关键靶点和与KEGG通路富集的癌症相关的通路作为节点构建“靶点-通路”网络，并利用软件Cytoscape 3.6.3对网络进行可视化处理并分析主要作用通路。

1.5 分子对接

将筛选出的主要活性成分通过PubChem下载SDF格式；将关键蛋白靶点通过PDB数据库，尽量选择分辨率Resolution（A）高，有配体、结构相对完整的晶体结构，并下载PDB格式文件。

将配体分子导入PyRx软件^[11]进行能量最小化处理。蛋白导入Auto Dock Tools，进行除水、加氢、计算电荷，原子类型设为Assign AD4 type。将处理好的配体分子导入PyRx软件的Ligands选项；蛋白导入Macromolecules选项，进行Run Vina计算分数。

2 结果

2.1 化学成分及其对应靶点的采集

通过TCMID数据库检索文殊兰的化学成分，将所有的化学成分通过Swisstargets数据库ADME参数的检索和筛选，得到15个符合要求的化合物，见表1。

2.2  癌症靶点基因与文殊兰治疗靶点的关联分析

通过Swisstargets和Batman数据库预测得到文殊兰主要成分的相关靶点，去重，共得到585个基因靶点。依据GeneCards、NCBI数据库挖掘得到癌症相关基因，去重后得到6538个靶点，将筛选出的药物靶点与疾病靶点输入Venny 2.1，得到339个共有靶点（图2），作为药物作用于疾病的预测靶点。

2.3  蛋白相互作用网络关系的建立和分析

将得到的文殊兰靶点数据导入Cystoscape3.6.3 中，通过度排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶点，共筛选出118个关键靶点（图3），节点颜色和大小根据度值调整，越大、颜色越深，度值越大。将排名前15个靶点作为核心靶点并使用R3.6.3进行拓扑分析（图4）。

2.4 “成分-靶点-疾病”网络的构建

用Cytoscape3.6.3软件处理得到文殊兰“成分- 靶点-疾病”相互作用关系网络（图5）。网络中黄色为药物作用于疾病的靶点，蓝色为文殊兰活性成分。表明文殊兰的抗肿瘤作用是基于多成分、多基因、多靶点的协同复杂作用。

2.5  GO富集分析

GO富集分析结果显示，根据错误发生率（false discovery rate，FDR）＜0.05，筛选出BP（如黏附、迁移、凋亡、周期等）2691个，CC（如细胞膜、细胞质等）225个，MF 164个，根据Count值排序，取前10，结果如图6所示，细胞生物过程富集的基因数较多，FDR值较低，说明文殊兰主要通过调节细胞生物过程发挥抗肿瘤作用。

2.6  KEGG通路富集分析

KEGG分析共富集到168条信号通路，其中25条癌症相关通路，并对25条通路进行可视化处理（图7）。根据KEGG通路分析，文殊兰可能对前列腺癌（prostate cancer）、胰腺癌（pancreatic cancer）、非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer）等多种癌症有治疗作用，文殊兰靶点-通路相互作用网络关系见图8，其与prostate cancer信号通路的靶点作用关系见图9。

2.7  分子对接

3 讨论

本研究采用网络药理学^[13]的方法，探索多组分、多靶点、多通路的复杂中药网络关系。基于网络药理学，发现文殊兰抗肿瘤的主要活性成分为生物碱类，确认文殊兰亭碱、石蒜胺和小星蒜碱等15个抗肿瘤活性成分，以及15个关键靶点，包括胰岛素（insulin，INS）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）、血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGFA）、表皮生长因子受体（epidermal growth factorreceptor，EGFR）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。KEGG富集出的通路与癌症相关的有25条，并通过分子对接技术进行半柔性对接，结果显示化合物与关键靶点均有结合活性，结构相对稳定。KEGG富集分析结果显示，前列腺癌、多聚糖肿瘤信号通路等与文殊兰抗肿瘤作用密切相关。因此，推断出文殊兰对前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌等多种癌症有治疗作用。

对接过程中，活性中心Gridbox的大小设置合理与否会直接影响到分子对接的准确性，故本研究以原配体抑制剂为活性口区域，合理设置分子对接的Gridbox大小。本研究通过TCMID、PubChem数据库从文殊兰中筛选出15个化合物，分别与15个关键靶点进行了分子对接。文殊兰中结合能小于−5 的活性成分有202个，占90%；小于−9 的活性成分有12个，占5.3%。已有研究表明，文殊兰中的菲啶型生物碱（水仙明、恩其明、且Lycorenine型生物碱活性大于石蒜型生物碱。结合分子对接结果，推测菲啶型生物碱、石蒜型生物碱、lycorenine型生物碱可能在文殊兰发挥潜在抗肿瘤作用中具有较大贡献。

分子对接结果显示，文殊兰亭碱与VEGFA、EGFR、丝裂原活化蛋白激酶（1mitogen-activatedprotein kinase 1，MAPK1）、MAPK8、雌激素受体α（estrogen receptor alpha，ESR1）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）等关键靶点结合能均≤−9 kJ/mol，说明文殊兰亭碱与以上靶点能很好的结合，同时KEGG富集分析到得的与癌症相关的通路大多涉及到以上基因。已研究表明，文殊兰亭碱对胰腺癌PNAC-1-LUC细胞、恶性黑色素瘤细胞SK-MEL-2、乳腺癌ZR-75-1细胞等一系列肿瘤细胞均有细胞毒作用^[14]。小星蒜碱与mTOR结合能力较好，mTOR相关信号通路磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol-3- hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/mTOR的激活与列腺癌的发生密切相关，在临床上常用PI3k/Akt/mTOR通路抑制剂治疗前列腺癌^[15-16]。因此，推测文殊兰中的核心化合物通过作用关键靶点VEGFA、EGFR、MAPK1、MAPK8、ESR1、mTOR等调控前列腺通路、胰腺癌通路、非小细胞肺癌通路、黑色素瘤通路、乳腺癌通路等信号通路起到抗肿瘤作用。

在这些关键基因中，Caspase-3是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，研究发现Caspase-3的过度表达可促进树突状细胞细胞的成熟并提高其抗肿瘤能力^[17]。Caspase-3是一种常被激活的死亡蛋白酶，催化其特异性裂解许多关键的细胞蛋白^[18]。体外实验表明，小星蒜碱能降低Caspase-3的表达，诱导小鼠肉瘤S₁₈₀细胞凋亡^[19]。同时，小星蒜碱能显著抑制人结肠癌Ht-29细胞和肝癌Hepg2细胞的增殖^[20]。甜菜碱型生物碱氧化石蒜碱对9种肿瘤细胞株具有细胞毒作用，其机制可能为促进肿瘤细胞坏死、自噬以及Caspases激活介导的细胞凋亡、激活基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）通路和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成^[21]。非洲防已苦素是一类二萜类呋喃化合物，具有多种药理活性，包括抗炎、抗肿瘤、体内抑制酶活性等^[22]。非洲防已苦素通过抑制结肠癌细胞的增殖，显著抑制偶氮甲烷诱导大鼠结肠发育的进展^[23]。水仙明被发现是一种新的抗肿瘤细胞增殖药物，对人急性淋巴细胞白血病CEM细胞具有明显的抑制细胞周期紊乱和凋亡诱导作用，其机制可能是由Caspase级联激活介导的凋亡作用^[24]。这与KEGG分析结果相符合，Caspase可能是结肠癌信号通路、白血病信号通路等通路的关键靶点，由此可以推断，诱导肿瘤细胞凋亡是文殊兰成分抗肿瘤作用的重要机制。

本研究通过网络药理学和分子对接相结合的方法，确认文殊兰抗肿瘤活性成分、关键靶点和信号通路，并基于分子对接初步模拟其可能分子作用机制。本研究结果为后续文殊兰的研究提供了理论基础和重要依据，这些信息可能有助于阐明文殊兰抗肿瘤的基本机制和识别潜在靶点，但未来需要对靶点和特定相互作用进行实验验证。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略） 

来  源：于  淼，李佳鑫，辛国松，綦  峥，薛沁冰 ，王  娟，王楠楠．基于网络药理学和分子对接的文殊兰抗肿瘤作用机制研究  [J]. 中草药, 2021, 52(11): 3321-3333 .