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摘 要：目的 利用斑马鱼模型和中医药整合药理学平台（TCMIP），探究天麻抗癫痫的主要活性成分及潜在的作用机制。方法 采用健康发育至72 h的AB系斑马鱼幼鱼为实验动物，以氨茶碱诱导形成癫痫模型，观察天麻对斑马鱼癫痫样行为的改善作用；利用TCMIP筛选天麻抗癫痫的靶点，构建天麻与癫痫的蛋白质相互作用（protein-proteininteraction，PPI）网络，绘制药材-成分-靶点-通路-疾病网络；利用Autodock vina软件对活性成分和靶点进行分子对接。结果 天麻对氨茶碱诱导的斑马鱼的癫痫样行为发生频率具有显著改善作用（P＜0.05）。通过TCMIP v2.0整合分析发现，天麻抗癫痫的核心靶点有25个，天麻素、天麻醚苷、谷甾醇、棕榈酸、西托糖苷可能是天麻抗癫痫的主要活性成分；这些活性成分可以直接作用于相应关键靶点，参与调节神经递质的平衡、维持神经元细胞正常电生理活动并影响酮体生成。结论 天麻对癫痫样症状具有明显的改善作用，其抗癫痫的潜在机制可能与调节神经递质的平衡、神经元细胞的电生理稳态和酮体的生成有关，为天麻的临床应用提供理论依据。 癫痫是一种由多种原因引起的复杂的神经系统疾病，常伴随运动、感觉、植物神经、意识等障碍，严重危害人类的健康。随着我国人口老龄化，老年人群中癫痫发病率呈上升趋势。难治性神经系统疾病的创新药物研发进展缓慢，现有的抗癫痫药物不良反应较大，因此，寻找新型、高效、低毒的抗癫痫药物仍然是临床迫切需要解决的问题[1]。天麻为兰科植物天麻Gastrodiaelata Bl.的干燥块茎，主产于湖北、四川、陕西等地[2]。《本草纲目》中记载天麻“眼黑头旋，风虚内作，非天麻不能治。天麻乃定风草，故为治风之神药”。研究发现，天麻对神经细胞损伤具有显著的保护作用，具有抗惊厥、防止癫痫大发作、镇静催眠、镇痛等作用[3-4]。中医临床治疗癫痫的处方中，其核心药味均有天麻[5]。但天麻抗癫痫的具体物质基础和作用机制仍有待深入挖掘。 目前用于癫痫疾病研究的模型主要为大鼠和小鼠模型，在大规模药物筛选方面具有局限性且成本较高。斑马鱼作为一种新兴的模式动物，基因组与人类同源性达到87%。研究发现，斑马鱼中可观察到啮齿动物类似的癫痫表型，且斑马鱼产卵量高、实验周期短、成本低，可以实现高通量筛选[6-8]。中医药整合药理学研究平台（TCMIP）作为一个专业的网络药理学工具，整合了中医药百科全书（ETCM）等优质的数据库资源，通过人工智能、网络可视化等先进的方法形成了其独特的优势，可以为研究天麻抗癫痫的潜在作用机制提供强大的数据支撑和计算辅助[9]。本研究采用模式动物斑马鱼观察天麻对癫痫发作的保护作用，并利用TCMIP平台分析其潜在机制。1.1 动物 AB型斑马鱼，由山东省科学院药物筛选技术重点实验室提供，饲养于斑马鱼养殖系统，温度设定为28 ℃，pH 6.8～7.5，14 h光照/10 h黑暗，用丰年虫早晚饲喂2次。实验所用幼鱼均由健康雌雄鱼以2∶1比例自然交配而得。1.2 药品与试剂 天麻（批号20191103）购自安徽六安，由山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学与制药科学学院韩利文副研究员鉴定为兰科植物天麻G. elata Bl.的干燥块茎；氨茶碱（质量分数为98%）、丙戊酸钠（质量分数为98%）购自阿拉丁试剂公司；天麻素（批号B21243，质量分数≥98%）购自源叶生物；乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。1.3 仪器 色谱系统、Shim-pack GIST C18色谱柱（100 mm×3.0 mm，2 μm）（日本岛津公司）；SZX-16型体视荧光显微镜（日本Olympus公司）；SPX-300B-G型博讯光照培养箱（上海基星生物科技有限公司）。 2.1 天麻提取物的制备及含量测定 天麻用粉碎机粉碎，过60目筛，称取10 g天麻粉末，置于500 mL圆底烧瓶中，加入100 mL 80%乙醇，加热回流提取2次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得到天麻提取物，于4 ℃保存，临用前用蒸馏水稀释至所需浓度。按照《中国药典》2020年版方法进行测定，以乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脱，检测波长220 nm，以天麻素为对照品，外标一点法计算，天麻提取物中天麻素的质量分数为1.24%。2.2 药液的配制 精密称定氨茶碱，溶于蒸馏水，配制成质量浓度为10 mg/mL的溶液；精密称定丙戊酸钠，溶于蒸馏水，配制成质量浓度为100 mg/mL的溶液。于4 ℃保存备用，临用前用蒸馏水稀释至所需浓度。2.3 斑马鱼实验 将正常孵化的受精后72 h（hours post- fertilization，hpf）斑马鱼幼鱼转移至6孔板中，设置模型组、丙戊酸钠（0.25 mg/mL）组和天麻提取物（0.1、1.0、10.0 mg/mL）组，每组10条。各给药组加入相应药物预处理24 h后，各组再加入氨茶碱（2 mg/mL）造模4 h，观察斑马鱼幼鱼活动情况，记录斑马鱼抽搐频率（1 min内发生抽搐的次数）。2.4 天麻活性成分和癫痫相关靶点的获取 以“天麻”为关键词，在TCMIP v2.0药材数据库功能模块中检索获得天麻的活性成分及靶点；以“癫痫”“癫痫痉挛”“癫痫性发作”“癫痫持续状态”为关键词在疾病相关分子库模块进行检索，获取癫痫相关的靶点。2.5 天麻与癫痫靶点蛋白质相互作用（protein- protein interaction，PPI）网络的构建及核心靶点的筛选 2.6 核心靶点（，GO）功能和通路富集分析 在中药网络调控机制挖掘结果界面中自定义关联网络可视化功能区，绘制网络图，将“2.5”项下补充的天麻与癫痫的共同靶点添加到网络图中。2.8 天麻活性成分与抗癫痫相关靶点的分子对接 将天麻活性成分和抗癫痫相关靶点进行分子对接，运用PubChem（https://pubchem.ncbi.h. gov/）找到活性成分的3D结构，进行能量最低处理。将从Uniprot（https://www./）中得到的蛋白名称输入RCSB PDB（https://www./）中，得到关联的蛋白质，进行纯净、加氢、加电荷等处理，运用AutodockVina[10]进行分子对接。2.9 数据分析 数据以表示，两组数据比较使用SPSS 18.0软件进行方差分析（ANOVA）。3.1 天麻对癫痫斑马鱼的保护作用 
3.2 天麻活性成分及癫痫相关靶点的获取
如表1所示，共收集到天麻的21个活性成分，分别为天麻素、天麻醚苷、谷甾醇、香草醛、琥珀酸、西托糖苷等，其中7个活性成分未检索到候选靶点，故未列出；共有233个候选靶点。通过疾病相关分子库共获得癫痫疾病描述的相关靶点共97个，其中“癫痫”20个、“癫痫性发作”1个、“癫痫痉挛”7个、“癫痫持续状态”69个。
3.3 天麻与癫痫靶点PPI网络的构建
如图2所示，天麻与癫痫靶点的PPI网络有55个节点，度值越高，其在网络中的作用越高。度值排名前10的节点分别为核受体辅激活因子1
3.4 核心靶点GO和KEGG富集分析
将核心靶点导入DAVID进行GO分析，得到P＜0.05的生物学功能条目共72条，其中生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）各39、13、19条，按照重要性选择前5条分别进行可视化分析，如图3所示。将核心靶点导入Reactome Pathway进行KEGG分析，共得到105条通路，将前30条进行可视化操作，如图4所示，涉及核受体转录过程（nuclear receptor transcription pathway）、基因转录途径（generic transcription pathway）、化学突触传递（transmission across chemical synapses）、β细胞发育的调控（regulation of β-cell development）、L1和锚蛋白类的相互作用（interaction between L1 and ankyrins）、细胞内受体的泛素化修饰（SUMOylationof intracellular receptors）、γ-氨基丁酸受体的激活（GABAreceptor activation）、门冬氨酸受体的释放及谷氨酸的结合与活化（unblockingof NMDA receptors，glutamate binding and activation）、27-羟基胆固醇合成胆汁酸和胆盐（synthesisof bile acids and bile salts via 27-hydroxycholesterol）等通路。
3.5 药材-成分-核心靶点-通路-疾病网络的构建
如图5所示，天麻的7种成分（天麻醚苷、天麻、谷甾醇、香草醛、棕榈酸、西托糖苷、琥珀酸）主要通过作用于NCOA1、NR3C1、ESR1、GABRA1等靶点以及胆汁酸、胆汁酸盐的合成和循环、γ-氨基丁酸受体的激活、门冬氨酸受体的释放、细胞内受体的泛素化修饰、核受体传导、琥珀酸半醛脱氢等通路，从而发挥抗癫痫作用。
3.6 分子对接结果
 4 讨论
大脑神经元的异常放电是癫痫的典型病因，与神经元突触的兴奋性和抑制性递质的平衡相关。生理状态下，神经元突触兴奋与抑制性递质平衡，神经元膜保持稳定状态，当兴奋性递质过多或抑制性递质过少时，膜的稳定性发生变化，产生异常放电。GABA和谷氨酸分别为最常见的抑制性和兴奋性神经递质[13]。GABRA基因变异会导致早发性癫痫和智力障碍[14]；GABRA基因变异能够加速电流变化、降低门控、减慢神经元的激活并产生更小的电流振幅，从而改变突触受体介导的抑制性突触后膜电流的时间进程，促进超兴奋性，产生癫痫或加剧癫痫[15]，表明神经元抑制性递质受损会导致癫痫。谷氨酸受体在突触可塑性、兴奋性神经递质传递和神经发育中发挥重要作用，当谷氨酸门控通道Ca2+通透性发生改变时，mRNA前体编辑的程度可能影成分-核心靶点-通路”网络图中，GABRA1、GABRA3、GABRA4、GABRA5、CALM1、GRIK1、GR1A4、ALDH5A1、ABAT均与抑制性神经递质和通过对ALDH5A1−/−小鼠进行研究，证实GR1A4是一个编码线粒体NAD＋依赖的琥珀酸半醛脱氢酶的基因，可催化GABA分流途径；当GR1A4缺乏时，编码GABAA受体的模板数量减少，GABA保持未成熟状态，发挥兴奋性作用[21]。ABAT是GABA分解的关键酶，当ABAT表达受到抑制时，GABA水平升高，对癫痫具有一定的保护作用[22]。本研究发现，天麻素和谷甾醇可能通过直接作用于GABRA、GRIA、ABAT、ALDH5A等靶点，参与GABA和谷氨酸的代谢调节，从而发挥抗癫痫作用。此外，天麻素也可能通过作用于CALM1参与神经元的修复，从而发挥抗癫痫作用[23]。天麻素可能通过作用于SCN和KCN相关受体保证离子转运的正常进行，维持膜的稳定性，从而来发挥抗癫痫作用。癫痫异常电生理活动的基础是离子的转运，调控相关离子的转运对癫痫的发生发展有一定的影响。钠离子通道可启动电神经元动作电位，编码钠离子通道α亚基的5种基因突变可导致癫痫[24]，钠离子通道阻滞剂可以用来治疗局灶性癫痫[25]。钾离子通道调节大脑中神经元和非神经元的电活动，是癫痫发作易感性的重要决定因素[17]，本研究发现，天麻素可能通过间接作用于SCN8A，抑制神经细胞自发性和重复性放电，维持神经元正常的生理活动[28-29]。天麻素、天麻醚苷、谷甾醇、西托糖苷可能通过作用于NCOA1和NCOA2参与胆汁酸和胆汁酸盐的合成及循环，从而参加体内酮的代谢过程，发挥抗癫痫作用。生酮、高脂、低糖饮食对癫痫具有治疗作用[30-31]。对比正常小鼠和基因工程小鼠的大脑切片发现，酮体可降低黑质网状部GABA能神经元的自发放电；酮体可以通过调节囊泡性谷氨酸转运体来抑制突触前谷氨酸的释放，从而抑制神经元兴奋性和癫痫发作[32]。在脂肪酸水平增加并超过最大三羧酸循环功能的情况下，如在禁食或生酮治疗期间，乙酰辅酶A转向酮生成[33]。胆汁酸在动物体内可以乳化脂肪，扩大与脂肪酶的接触面积，促进脂肪水解生成脂肪酸等代谢产物，从而间接提高酮体的生成[34]。综上所述，本研究通过斑马鱼模型快速评价了天麻的抗癫痫作用，利用TCMIP平台探究了天麻抗癫痫的潜在作用机制，发现天麻中的天麻素、天麻醚苷、谷甾醇、棕榈酸、西托糖苷可能通过作用于NCOA1、NR3C1、ESR1、GABRA1等25个核心靶点，调节神经递质的抑制与兴奋的平衡、维持神经元细胞的正常电生理活动并参与酮体生成，从而发挥抗癫痫作用，体现了中药治疗疾病整体性、多靶点、网络调节的特点，并为癫痫的防治提供了理论依据。志谢：山东省科学院药物筛选技术重点实验室提供斑马鱼支持。 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献（略） 来 源：裴文强，单 毅，张友刚，贾献慧，汪海洋，王晓静，田青平，韩利文，姚庆强．基于斑马鱼模型与中医药整合药理学平台研究天麻的抗癫痫作用及潜在机制 [J]. 中草药, 2021, 52(7): 2003-2010.
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