《科学》子刊：T细胞未入肿瘤先“丧胆”，免疫治疗也“一筹莫展”

非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常见的一类。携带EGFR、ALK、ROS1等基因突变的NSCLC患者，临床建议使用对应的靶向药物进行治疗。而携带KRAS突变NSCLC患者，则可采用免疫检查点阻断疗法（ICB）治疗[1-3]。

从现有的研究来看，ICB的治疗效果跟与KRAS同时存在的其他基因突变有关。比如，同时存在KRAS和LKB1/STK11突变的肿瘤，往往浸润T细胞数量很少，对ICB治疗响应较差[4]。

让人意外的是，在同时存在KRAS和TP53突变的NSCLC中，虽然有着丰富的T细胞浸润，但ICB的实际治疗响应率却也只有35%左右[3-4]。这种差异表明，在KRAS/TP53突变的NSCLC中，并非所有的肿瘤浸润T细胞都对ICB有反应，因此需要更好地了解肿瘤反应性T细胞的功能状态。

有研究指出，ICB对NSCLC患者的治疗效果受T细胞激发的PD-L1表达影响[5]。因为当肿瘤微环境内部分T细胞功能异常，可能就无法产生足够多的IFNγ来刺激PD-L1表达。据统计，在NSCLC患者群体中，肿瘤组织既有丰富T细胞浸润，又是PD-L1表达阳性患者比例恰好将近40%[6]，很可能就对应ICB疗效好的那类人群。而PD-L1阴性、T细胞浸润的NSCLC患者对ICB的反应很差。

由此研究人员推测，并不是所有T细胞在浸润到肿瘤组织后，都会对ICB治疗敏感，有可能存在一群“摸鱼”的T细胞，不能有效杀灭肿瘤细胞，也无法被ICB重启。

近日，麻省理工大学生物学院的Stefani Sprange团队在Science immunity期刊上发表重要研究，就揭开了其中的奥秘[7]。他们发现：原来ICB治疗效果大打折扣是因为有群异常的T细胞，它们甚至在进入肿瘤之前就发生了基因表达变化而功能紊乱，更无法被ICB重启杀伤肿瘤细胞的能力。

▲ 论文首页截图

为了搞清楚为什么有些肿瘤浸润T细胞不行，Sprange团队先分别在小鼠的肺原位和皮下种植KP肺癌细胞（KRAS G12D突变和P53缺失）构建了两种体内肺癌模型，再给与相同ICB治疗。结果显示，ICB治疗对皮下瘤有效，而对肺原位瘤疗效甚微。研究人员发现肺部肿瘤内浸润的淋巴细胞远比皮下瘤内的更丰富，也说明T细胞浸润数量并不是ICB效果的决定因素。

接下来，研究人员将两处肿瘤内的免疫细胞进行单细胞测序，结果发现在皮下瘤内有较多高表达效应T细胞分化和耗竭基因的CD8 c1 T细胞群；而在肺部肿瘤内则富集到了另外一群CD8 c2 T细胞，它们上调有关T细胞存活和归巢类基因的表达，同时还缺乏正常的T细胞耗竭基因表达，提示这类细胞可能处于异常的T细胞功能紊乱状态，因而降低了对ICB的响应。于是CD8 c2 T细胞被研究人员列为“首要嫌疑人”，并命名为——TLdys。

▲ ICB治疗响应较差的肺原位瘤中TLdys的基因分型

那么这群TLdys到底是哪来的呢？

研究人员开始探索两处肿瘤内T细胞差异的来源。他们分别检测了两类T细胞受体识别抗原序列的相似度，对同种抗原的识别差异以及相关功能基因改变情况。结果显示，它们的抗原受体数量和功能相似，而给与同样较强的抗原刺激后，两类T细胞都对抗原都有响应，并且它们各自的基因特点也没变，说明抗原识别不是二者差异的原因。

研究人员又猜想肿瘤微环境可能是TLdys形成的关键因素。于是，Sprange团队先将肺部和皮下瘤的T细胞分选出来，再打到Rag2敲除鼠体内（B和T细胞缺陷），并在数周后向该小鼠再次皮下注射KP细胞。结果发现，注射皮下肿瘤内T细胞依旧比注射TLdys更能延缓体内KP肿瘤的进展，表明TLdys不会因所处的肿瘤微环境再发生改变，而是在早期就处于一种持续性的功能紊乱状态了。

研究人员决定继续追寻两种T细胞间的早期差异来源，于是回溯到T细胞进入肿瘤前的定居地：分别是对应肺原位肿瘤的肺纵隔淋巴结（MLN），还有对应皮下肿瘤的腹股沟淋巴结（ILN）。

研究人员发现在肺原位KP瘤内的IFNγ水平降低，于是猜想可能是T细胞早期在MLN和ILN内增殖情况不同所致。他们将识别特定抗原刺激、并用CFSE标记过的T细胞，在第7天同步种植到两种荷瘤小鼠体内，但第10天检测结果却说明两类T细胞的增殖情况并无差异。

于是，研究人员再次对MLN和ILN内T细胞进行单细胞测序检测。经对比后发现MLN和ILN的T细胞之间的差异基因，与之前两处肿瘤内T细胞表达的差异基因基本一致，锁定了T细胞紊乱的“案发地点”确实是在进入肿瘤前的纵隔淋巴结内。

▲ 纵隔淋巴结内的TLdys在启动时没有发生正常的T细胞效应

那么，在MLN内的T细胞为何就无法对ICB正常响应了呢？

Sprange团队对测序结果深入分析后发现，TLdys细胞与传统耗竭前T细胞不同。后者主要由TCF1 CD8 耗竭T细胞或者发育为TIM3 CD8 效应T细胞构成。而ICB治疗也正是通过靶向TCF1 CD8 耗竭T细胞，从而将其重新激活成为TIM3 CD8 效应T细胞来发挥作用[8-10]。

但TLdys细胞由于TIM3的编码基因Havcr2下调，无法正常分化为TIM3 CD8 效应T细胞。因此虽然TLdys细胞的确被抗原激活，但是却无法被ICB重启为效应T细胞，制造关键性的“武器”TNF-α和IFN-γ的能力也存在缺陷，所以对肿瘤细胞杀伤能力明显不足。

为了检验该结论是否符合体内真实情况，Sprange团队在患者体内同样证明：的确存在这样一群没有发挥正常功能，但又没有耗竭，对ICB响应差的TLdys细胞。并且结合数据库信息归纳梳理，同样也说明了ICB治疗耐受的那部分细胞更可能是这群TLdys细胞，而不是传统的耗竭性T细胞。

▲ TLdys的功能状态与传统的耗竭T细胞有所不同

那么对于这部分TLdys细胞，能不能让它回心转意、继续战斗呢？

Sprange团队回想到在TLdys中富集到下调的IL2-STAT5信号通路。他们发现TLdys中相关细胞因子受体表达较低。为了抵消劣势，研究人员在ICB治疗的基础上，再补充适量细胞因子IL2和IL12，结果发现之前对ICB响应差的TLdys重获对抗肿瘤的能力，这意味着细胞因子疗法可以预防甚至可能逆转T细胞功能障碍。

▲ IL2和IL12联合ICB有效治疗NSCLC

最终，经过Sprange团队抽丝剥茧的追寻，终于找到这一群“意志消沉”的TLdys细胞，它们虽然还可以浸润到肿瘤细胞中，但缺少效应功能因子以及衰竭基因的表达，无法正常发挥肿瘤杀伤作用，也不是正常耗竭状态，所以最终对ICB响应差。

而此项研究结果说明，摸清楚T细胞状态对抗肿瘤免疫疗效的预测同样至关重要。并且，研究人员还提出了有效的联合治疗策略，但鉴于细胞因子治疗的诸多副作用和危险性，仍需要许多研究和不断的尝试。

也许在不远的将来，科学家们会摸索出恰到好处的细胞因子治疗方案，能够将ICB发扬光大，进而拯救更多的NSCLC患者。

参考文献：

[1] Doroshow DB, Sanmamed MF, Hastings K, et al. Immunotherapy in Non-Small Cell Lung Cancer: Facts and Hopes. Clin Cancer Res. 2019;25(15):4592-4602. doi:10.1158/1078-0432.CCR-18-1538.

[2] Brahmer JR, Govindan R, Anders RA, et al. The Society for Immunotherapy of Cancer consensus statement on immunotherapy for the treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC). J Immunother Cancer. 2018;6(1):75. Published 2018 Jul 17. doi:10.1186/s40425-018-0382-2.

[3] Skoulidis F, Byers LA, Diao L, et al. Co-occurring genomic alterations define major subsets of KRAS-mutant lung adenocarcinoma with distinct biology, immune profiles, and therapeutic vulnerabilities. Cancer Discov. 2015;5(8):860-877. doi:10.1158/2159-8290.CD-14-1236.

[4] Skoulidis F, Goldberg ME, Greenawalt DM, et al. STK11/LKB1 Mutations and PD-1 Inhibitor Resistance in KRAS-Mutant Lung Adenocarcinoma. Cancer Discov. 2018;8(7):822-835. doi:10.1158/2159-8290.CD-18-0099.

[5] Herbst RS, Soria JC, Kowanetz M, et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 2014;515(7528):563-567. doi:10.1038/nature14011.

[6] Tokito T, Azuma K, Kawahara A, et al. Predictive relevance of PD-L1 expression combined with CD8 TIL density in stage III non-small cell lung cancer patients receiving concurrent chemoradiotherapy. Eur J Cancer. 2016;55:7-14. doi:10.1016/j.ejca.2015.11.020.

[7] Horton BL, Morgan DM, Momin N, et al. Lack of CD8  T cell effector differentiation during priming mediates checkpoint blockade resistance in non-small cell lung cancer. Sci Immunol. 2021;6(64):eabi8800. doi:10.1126/sciimmunol.abi8800.

[8] Hudson WH, Gensheimer J, Hashimoto M, et al. Proliferating Transitory T Cells with an Effector-like Transcriptional Signature Emerge from PD-1 Stem-like CD8 T Cells during Chronic Infection. Immunity. 2019;51(6):1043-1058.e4. doi:10.1016/j.immuni.2019.11.002.

[9] Miller BC, Sen DR, Al Abosy R, et al. Subsets of exhausted CD8 T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade [published correction appears in Nat Immunol. 2019 Nov;20(11):1556]. Nat Immunol. 2019;20(3):326-336. doi:10.1038/s41590-019-0312-6.

[10] Sade-Feldman M, Yizhak K, Bjorgaard SL, et al. Defining T Cell States Associated with Response to Checkpoint Immunotherapy in Melanoma [published correction appears in Cell. 2019 Jan 10;176(1-2):404]. Cell. 2018;175(4):998-1013.e20. doi:10.1016/j.cell.2018.10.038.

责任编辑丨BioTalker