【原】CRISPR/Cas9技术在CAR-T免疫疗法中的应用

目前，CRISPR/Cas9技术一方面被广泛的用于通用型CAR-T细胞的开发，扩展CAR-T细胞的应用范围；另一方面也被广泛的用于包含T细胞在内的免疫细胞的修饰，以增强其抗肿瘤效果。虽然，CRISPR/Cas9技术的应用仍然面临着许多安全性、有效性等问题，但毫无疑问该技术将在下一代新型的CAR-T技术开发中具有重要的作用。

1、使用CRISPR/Cas9技术

破坏影响T细胞功能的抑制性分子

肿瘤细胞可以通过表达负性信号通路调节分子来抑制免疫反应或者逃脱免疫细胞的杀伤，这些负性信号通路分子被称作免疫检查点。PD1是一个重要的免疫检查点分子，其信号通路的活化可以显著抑制T细胞的增殖和免疫反应。

目前CRISPR/Cas9编辑的TCRα基因和PD-1基因敲除CAR-T细胞临床应用的安全性及其治疗的可行性已经在一项研究中得到了验证。在一项研究中，研究者发现：CRSISPR/Cas9对内源性的TCRα和PD-1基因有着较高的编辑效率，但对TCRβ基因的编辑效率较低。同时，该项研究结果显示CRISPR/Cas9编辑的T细胞在体内能够存活近9个月，而且仅有低水平的临床毒副作用[4]。

在另外一项研究中，Rupp等人通过电转的方式将Cas9和靶向PD-1基因1号外显子的sgRNA转入T细胞中，随后用含有CD19 CAR基因的慢病毒转染该细胞。结果显示：在PDL1＋CD19＋肿瘤细胞构建的小鼠模型中，PD-1基因敲除的CD19 CAR-T细胞能够有效的清除肿瘤细胞。这一结果表明PD-1/PDL1信号通路在调节T细胞功能方面具有重要的作用[5]。

2、抗自杀型CAR-T细胞的构建

最近有一种新型的靶向CD7的抗自杀的CAR T细胞的研究报道，在该项研究中，研究人员使用CRISPR/Cas9技术对T细胞的TCR和CD7分子进行了敲除，TCR的敲除能够避免CAR-T用于异体治疗时引起的GVHD风险，CD7的敲除使CAR-T细胞能够避免相互自杀。

在该项研究中，CD7 CAR-T细胞在体内外多种CD7+白血病细胞系和肿瘤动物模型中均展现出了良好的抗肿瘤活性，同时并未引起GVHD反应。因此，该项CD7 CAR-T技术的开发对复发难治性的急性T淋巴细胞白血病以及非霍奇金T细胞淋巴瘤的治疗将具有极其重要的意义[6]。

3、降低CAR-T细胞临床应用中的细胞因子风暴

考虑到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）在诱发细胞因子风暴（中的重要作用，一些研究者聚焦于如何减弱GM-CSF对细胞因子风暴的诱发。GM-CSF在造血干细胞分化以及增殖方面具有重要作用。

2019年，Sterner等人使用CRISPR/Cas9对CD19 CAR-T细胞的GM-CSF基因进行敲除。该项研究结果表明，GM-CSF基因敲除的CAR-T细胞的GM-CSF的分泌的确明显减弱，但是对CAR-T细胞的重要功能并未造成影响，更重要的是GM-CSF缺陷的CD19 CAR-T细胞比野生型的CD19 CAR-T细胞在体内具有明显的抗肿瘤效果[7]。

4、通用型CAR-T细胞的制备

通用型CAR-T（UCAR-T）细胞可以使用健康供者的T细胞来制备，同时还可以实现批量生产，产品均一性更好，可以大大拓宽CAR-T细胞免疫疗法的应用范围。因此，通用型CAR-T细胞治疗产品是下一代CAR-T细胞开发的重要方向。

目前通用型CAR-T细胞的开发主要是通过对T细胞TCR基因和β2M基因的敲除或者沉默来实现的，而CRISPR/Cas9基因敲除技术是通用CAR-T开发应用的主流技术。Eyquem等人使用CRISPR-Cas9技术对TCRα恒定区进行敲除，其sgRNA靶向位置为TCRα第一个外显子的5'端，随后使用AAV将被同源臂包围的CD19 CAR基因序列递送到该细胞中，通过同源重组的方式将CD19 CAR基因插入TCR位点，结果显示接近95%的T细胞的TCR被敲除。进一步的NALM6小鼠体内肿瘤模型实验结果显示：仅仅回输1×105个CAR-T细胞便能够有效的控制肿瘤细胞的生长，同时仅有2%的T细胞表达PD1、LAG3和TIM3等抑制性受体[8]。这些抑制性受体的低表达可能是取得良好的抗肿瘤效果的主要原因。这一研究结果为我们描绘了如何通过基因编辑技术来增强CAR-T细胞抗肿瘤效果的美好图景。