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作者 l At.Zhou 编辑 l 小卒子 在今年2月23号，Gilead旗下公司Kite与Sangamo Therapeutics达成全球合作，使用Sangamo的锌指核酸酶ZNFs技术平台开发下一代肿瘤学离体细胞治疗。根据协议的条款，Sangamo将获得1.5亿美元的预付款，并有资格获得高达30.1亿美元的潜在付款。这并不是CAR-T与基因编辑的第一次合作，早在2015年1月，Novartis宣布与Intellia Therapeutics展开一项长达5年的研发合作计划，主要致力于加速发展CRISPR/Cas9技术在CAR-T细胞治疗的应用；同年5月，Juno与Editas签订了一项为期三年的合作协议，将借助Editas公司开发的CRISPR/Cas9技术辅助公司现在开发的CAR-T疗法和TCR疗法治疗更多类型的肿瘤类型，这项协议包括了4700万美元预付款和6亿9千万美元的里程碑奖金。 2017年可以被称为细胞免疫治疗元年，Novartis的CAR-T产品Kymriah和Kite的产品Yescarta的获批上市，极大地推动了细胞免疫治疗研发的热情，而CAR-T与基因编辑合作，其碰撞的火花将会促进新一代细胞免疫治疗的发展。 现在绝大多数的CAR-T临床实验都是使用的自体型CAR-T，但是病人自身的T细胞通常都存在质量与数量的缺陷；且自体型CAR-T的生产成本更加昂贵，大约为通用型CAR-T的五倍；自体型CAR-T需要私人定制，而通用型CAR-T能够做到现货供应（off-the-sheff），节约时间。然而异体型T细胞上的抗原受体TCR可能会识别接受者体内的异体抗原，从而引发移植物抗宿主病（GVHD）；此外，异体T细胞上的HLA表达也会迅速地引起宿主免疫细胞排斥反应。因此使用ZFNs，TALENs以及CRISPR/Cas9等基因编辑工具，敲除异体T细胞上的TCR，MHC以及相关信号通路基因，从而防止异体型CAR-T的宿主排斥反应，是实现通用型CAR-T的关键一步。此外敲除PD1与CTLA4等T细胞抑制信号分子，能够进一步增强CAR-T细胞的功能。 此次与Kite达成合作的Sangamo是ZFNs技术的专利拥有者，Sangamo目前有多项使用ZFNs基因编辑治疗罕见病临床试验正在进行中。Editas Therapeutics与Intellia Therapeutics则是基因编辑技术CRISPR/Cas9的领跑者，其创始人分别为学术大牛张峰和Jennifer Doudna。而走在通用型CAR-T研发最前沿的是法国公司Cellectis，其利用自身Talens技术平台研发的UCART已处于临床阶段。本文将主要介绍UCART的产品和生产过程，以及CRISPR/Cas9技术用于编辑CART细胞的最新进展。 UCART产品介绍 ▲ Cellectis公司UCART简介 目前Cellectis公司有两款UCART产品正处于临床实验阶段，UCART19和UCART123。其中UCART19携带靶向CD19的CAR，主要用于治疗急性淋巴白血病（ALL）；UCART123携带靶向CD123的CAR，CD123主要在急性髓细胞性白血病（AML）以及BPDCN的白血病细胞上表达。 ▲ UCART19和UCART123 UCART19和UCART123都采用的是第二代CARs，使用了鼠源的scFV，含有41BB和CD3ζ两个共激活结构域；此外在CAR上还添加了一个RQR8基因，RQR8是一个136aa的蛋白，它能够被CD34的抗体QBEnd10识别，因此能够通过Miltenyi CliniMACS的CD34筛选系统进行临床级别的分选；此外RQR8还含有两个利妥昔单抗的模拟表位，能够在发生安全问题时，通过利妥昔单抗迅速清除CAR-T细胞。 ▲ UCART的CAR构建设计 此外，对于UCART19和UCART123，它们都是用了TALEN技术敲除了TRAC基因，从而降低了移植物抗宿主病的风险。在UCART19中还额外敲除了CD52基因，由于在注射UCART19细胞前，急性淋巴细胞白血病ALL患者通常需要接受淋巴细胞耗竭的化疗与anti-CD52（alemtuzumab）血清疗法，因此UCART中敲除CD52基因能够避免UCART产品受到alemtuzumab的影响。 ▲ UCART19 TALEN设计与TALEN转染后蛋白表达水平 UCART GMP 生产过程 ▲ UCART GMP生产过程 UCART初始材料：健康捐赠者细胞 所有的捐献者都需要经过挑选，筛选（采集前的14天内）和检测（采集的当天）。 从MNCs中分离淋巴细胞（一般的产量大于4x109 cells），一次UCART生产的初始细胞数目通常为收集到细胞的1/5-1/3（109 cells左右）。 Day1到Day4：第一次T细胞改造（慢病毒感染） Day5: 第二次细胞改造（TALEN介导的基因编辑） TALEN能够识别和切割TRAC与CD52基因组DNA，形成的DNA双键裂断由非精准的NHEJ修复方式修复从而导致TRAC与CD52基因的敲除。 Day6到Day17：细胞扩增 Day18-19：细胞纯化与分装 细胞的分装与冻存。每个产品一般都会有2-3种剂量形式，用以满足可能的剂量递增需求。 UCART的QC标准 ▲ UCART的QC标准 UCART19与UCART123临床结果 然而UCART123的临床实验颇为不顺，在2017年9月UCART123在治疗BPDCN一期临床试验中出现了一例病人死亡，该病人在第8天经历了5级的CRS和4级的CLS，并在第9天死亡。在UCART123在治疗AML的一期临床试验中，一位病人在第9天经历了3级的CRS和4级的CLS，但最终脱离了生命危险。目前UCART123的两个临床实验已经被FDA叫停。UCART123的安全性问题可能出在靶点CD123上，由于CD123虽然在肿瘤细胞过度表达，但正常细胞也有表达。强生和Genmab的CD123/CD3双特异抗体JNJ63709178去年发生一例严重毒副反应，临床试验被暂时叫停。Stemline的免疫毒素（CD123/白喉毒素）年初也在一个BPDCN临床试验中造成三例CLS死亡事件。 安全性问题一直是CAR-T细胞治疗中的重中之重，2017年JUNO的CAR-T产品就因为出现两次病人死亡情况被FDA叫停，从而被Novartis和Kite超越。而对于通用型CART，其面临的安全性问题压力更大，UCART123被叫停，UCART19虽然还未出现与产品相关的严重副作用，但是临床试验中也出现了多名患者死亡。因此，通用型CAR-T的设计和优化，以及临床实验中出现的CRS等都应该被小心对待。 CRISPR/Cas9与T细胞编辑 在2015年，研究者们使用CRISPR首次成功编辑了T细胞，他们使用的是Cas9蛋白与sgRNA的RNP复合物电转，其编辑效率能够达到55%。随后研究者们使用了编码Cas9的mRNA与sgRNA共电转，其编辑效率也能够达到60%以上。虽然研究者们也成功使用了慢病毒，AAV等病毒载体递送CRISRP/Cas9进行T细胞编辑，但是其编辑效率很低。目前病毒载体在T细胞中效率低的原因还不得而知，可能的一个猜测是在T细胞中，需要快速大量的表达Cas9蛋白。 ▲ 利用不同方法递送CRISPR/Cas9进行T细胞编辑 ▲各种CRISRP/Cas9的递送方式在编辑T细胞时的比较 T细胞编辑的一个挑战是如何能在较短的时间窗口，完成高效的基因编辑。由于激活的T细胞比naïve T细胞更容易接受外源的核酸与蛋白质，但是多次刺激T细胞会导致T细胞衰竭，肿瘤杀伤能力降低，因此在生产T细胞产品时需要优化好实验步骤，以达到高效的编辑。目前比较通用的方法是在T细胞激活后的Day1，使用慢病毒转染表达CAR，在Day3和Day4使用RNPs或者编码Cas9的mRNA与sgRNA进行电转，最终得到的CART产品中能达到>70%的CAR转导效率与>60%的基因编辑效率。 此外，为了达到敲除多个基因的目的，使用多个sgRNA共转T细胞可能会产生较高的细胞毒性；使用Cas9 RNP多元复合物会降低细胞毒性，但是会损失一定的编辑效率。有研究者开发了One-shot CRISPR system，将多个sgRNA组装进了CAR所在的慢病毒载体中，这样就只需要在Day3单独电转Cas9的mRNA就能够达到编辑的效果，从而减少多个共转造成的细胞毒性。此外，如何提高慢病毒或者AAV递送CRISPR/Cas9编辑T细胞的效率，也是降低通用型CART生产成本，扩大生产规模的重要因素。 安全性问题一直是CAR-T细胞治疗中的重中之重，通用型CAR-T面临着更大的安全性考验。在能保证安全性的条件下，通用型CAR-T与自体型CAR-T相比有着明显的优势。希望Cellectis的UCART临床实验带来更多令人振奋的结果与信息，希望CRISPR/Cas9技术能在T细胞编辑上有更大地突破，也希望CAR-T巨头和基因编辑公司的强强联合，早日为我们带来新一代的免疫细胞疗法。 参考资料： 欢迎加入小编团队成为小编一员 请加小编微信号：wuwenjun7237 如有技术解读、行业洞见愿意分享 |
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